宫腔灌注粒细胞刺激因子对反复种植失败患者妊娠结局的作用*

张曦倩, 罗燕群, 许虹, 朱秀兰, 董梅, 刘风华

广东省妇幼保健院生殖中心(广东广州 511400)

随着生育年限的推迟，不孕症患者人数剧烈增加，接受体外受精-胚胎移植治疗的不孕夫妇比例急剧增高。然而目前体外受精-胚胎移植术(IVF-ET)中单个移植周期胚胎植入率仅有20%～30%左右，妊娠率约50%，累积妊娠率达80%左右，但仍有近10%的女性患者多次移植胚胎均未能成功植入子宫内膜，通常称之为反复种植失败(recurrent implantation failure, RIF)[1]。国内外较为公认的RIF定义为年龄<40岁，连续3次及以上鲜胚或冻胚移植, 至少移植4个优质胚胎, 未获得临床妊娠。目前认为，胚胎的质量和子宫内膜容受性具有重要的影响，其中，子宫内膜容受性占2/3[2]。子宫内膜容受性是指子宫内膜处于允许胚胎黏附、穿透并植入的一种状态，称为种植窗期。此时内膜除受内分泌系统调控外，免疫系统也参与了胚胎种植过程的调节[3]。近年来，随着生殖免疫的发展，人们逐渐认识到免疫因素在RIF中的重要作用。多年来，很多学者尝试了不同的治疗方式，试图对种植窗期子宫内膜进行免疫调节，其中包括淋巴细胞主动免疫、子宫内膜轻刮术、静脉滴注免疫球蛋白、口服泼尼松和阿司匹林、宫腔灌注外周血单个核细胞[4]和自体淋巴细胞等，取得了一定的效果，但妊娠率仍无法满足临床的要求[5]。粒细胞刺激因子(granulocyte-stimulating factor, G-CSF)是正常妊娠母胎对话中调节子宫内膜免疫细胞功能的重要细胞因子之一。已有研究证明，外源性G-CSF是一个强有力的NK细胞数量和功能抑制剂，提示宫腔灌注可能调节子宫局部免疫或降低子宫内膜的免疫异常[6]。基于上述研究，提示经G-CSF对子宫内膜容受性起正向的调节作用，可能有助于胚胎的种植。但目前对于G-CSF宫腔内灌注治疗体内研究甚少[7]。本研究对30例拟行冷冻胚胎移植的RIF患者进行G-CSF宫腔内灌注治疗，并与20例对照组RIF患者妊娠结局比较，探讨G-CSF宫腔内灌注治疗对RIF患者妊娠结局的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 研究对象为2016年3月至2018年12月间来我院就诊的不孕不育症患者。RIF患者入选标准：(1)年龄20～39岁女性；(2)新鲜或冻融胚胎移植的反复种植失败的不孕症患者； (3)连续移植3次累积超过4个优质胚胎者均未获临床妊娠患者。

对照组入选标准：输卵管因素(输卵管积水除外)或者男方因素行IVF/卵泡浆内单精子注射(ICSI)助孕且临床妊娠成功分娩的患者。

排除标准：(1)年龄<20岁或≥40岁；(2)子宫解剖异常：纵隔子宫、双角子宫、双子宫、单角子宫、始基子宫等；(3)子宫和宫腔器质性病变：宫腔内膜息肉、结核、子宫肌瘤等; (4)宫腔镜证实宫腔粘连；(5)慢性疾病(如高血压、糖尿病)、精神病等；(6)子宫内膜异位症；(7)子宫内膜菲薄；(8)宫腔镜或者病理结果证实子宫内膜炎未经治疗患者；(9)血栓前状态。

1.2 方法

1.2.1 分组方法 按随机数表法将研究者分成治疗组(宫腔灌注G-CSF治疗组)和对照组(口服5 mg强的松治疗组)。

1.2.2 宫腔灌注治疗时间 第1次灌注治疗时间：自然周期卵泡晚期或者激素补充治疗(HRT)人工周期补充雌激素12 d左右；第2次灌注治疗时间：自然周期排卵日或者HRT人工周期孕酮添加行内膜转化日行宫腔灌注治疗。

1.2.3 宫腔灌注的操作步骤 G-CSF(瑞白，齐鲁制药有限公司，国药准字$19990049)宫腔灌注患者均签署书面知情同意书。常规外阴阴道消毒后，1 mL注射器连接COOK一次性人工授精管，抽吸G-CSF 150 μg缓慢注入宫腔。宫腔灌注后患者卧床30 min，每5 min改变体位1次，让药物涂布宫腔。子宫内膜厚度和血流均为黄体酮转化日经阴道B超测量获取，均由同一名主治医师完成测量。

1.2.4 胚胎冷冻及解冻 利用玻璃化冷冻/解冻液和Cryotop冷冻载体进行卵裂期胚胎冷冻/解冻。复苏后胚胎卵裂球数目大于或等于冷冻胚胎卵裂球数目一半则为复苏存活胚胎。

1.2.5 胚胎评分标准 根据Peter卵裂期胚胎评分系统选择优质胚胎进行胚胎移植。

1.2.6 子宫内膜的准备方案 将研究对象分为两种不同的处理方式，其中月经规律、正常排卵或内膜厚度≥8 mm的研究对象行自然周期；否则行雌孕激素替代疗法,即人工周期。

1.2.7 胚胎的移植方法 在B超的介导下将载有胚胎的移植管置入患者的子宫内，将要移植的胚胎注入宫腔内，停留片刻，随后退出移植管。

1.2.8 移植后黄体支持治疗与随访 移植后常规激素治疗，移植后的第14天进行血清人绒毛膜促性腺激素(HCG)水平检测并判断与否。HCG阳性者为生化妊娠，并继续动态监测血清HCG，胚胎移植后1个月行超声检查，如可见孕囊或胎心搏动，即诊断为临床妊娠。

2 结果

2.1 研究对象一般情况 本研究共纳入59例拟行冷冻胚胎移植的RIF患者，对照组29例，平均年龄为(35.3±3.2)岁，治疗组30例，平均年龄为(34.5±3.6)岁，差异无统计学意义(P>0.05)。两组患者血清卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、雌二醇(E2)均差异无统计学意义(P>0.05)。两组患者取卵周期数、移植周期数、移植胚胎数、单周期移植优质胚胎数均差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 冷冻胚胎移植前内膜准备情况 对照组中采用人工周期的患者为13个，采用自然周期的患者为17个，平均子宫内膜厚度为(9.6±2.1)mm，治疗组中采用人工周期的患者为14个，采用自然周期的患者为16个，平均子宫内膜厚度为(9.8±1.8)mm，二者对比均差异有统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.3 移植胚胎的情况 对照组共解冻冷冻胚胎87枚，存活胚胎82枚，存活率为94.3%。治疗组共解冻冷冻胚胎90枚，存活胚胎84枚，存活率为93.3%，差异无统计学意义(2=0.002、P=0.964)。对照组在29个移植周期内共移植胚胎82枚，平均移植(2.8±0.6)枚优质胚胎。治疗组在30个移植周期内共移植胚胎84枚，平均移植(2.8±0.4)枚优质胚胎。两组对比，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

2.4 妊娠结局的比较 对照组胚胎种植率为11.0%(9/82)，治疗组胚胎种植率为23.8%(20/84)，治疗组胚胎种植率高于对照组 (P>0.05)。对照组临床妊娠率为17.2%(5/29)，治疗组临床妊娠率为53.3%(15/30)，治疗组临床妊娠率高于对照组，且差异有统计学意义(P>0.05)。对照组单周期活婴出生率为17.2%(5/29)，治疗组单周期活婴出生率为53.3%(16/30)。治疗组胚胎活婴出生率高于对照组(P<0.05)，见表3。

项目对照组治疗组t值P值例数2930年龄35.3±3.234.5±3.60.9010.371BMI(kg/m2)21.8±2.222.0±2.50.3260.746不孕年限(年)7.2±2.47.4±2.60.3070.761FSH(IU/L)5.8±1.95.4±2.30.7270.470LH(U/L)5.3±1.35.5±1.20.6150.542E2 (pmol/L) 164±14.7168±15.41.0200.313取卵周期数(个)3.5±1.23.2±1.60.8130.420移植周期数(个)4.6±1.74.2±1.50.9590.342移植胚胎数(枚)2.4±0.42.6±0.51.6930.096单周期移植优质1.7±0.81.8±0.70.5120.611 胚胎数(枚)

表2 两组冷冻胚胎移植周期内膜准备方案比较例(%)

项目对照组治疗组t/2值P值移植周数2930移植胚胎总数8284临床妊娠周期数[例(%)]5(17.2)16(53.3)8.3790.004胚胎种植数[例(%)]9(11.0)20(23.8)4.7400.030平均移植胚胎数2.8±0.62.8±0.40.0010.999平均移植优质胚胎数(枚)2.2±0.82.4±0.61.0890.281活婴出生数5168.3790.004

3 讨论

妊娠作为一种同种异体移植，需避免母体免疫系统对胎儿产生排斥作用。因此，子宫局部免疫系统能否耐受胚胎抗原直接影响了妊娠的建立和维持[8]。

近年来，控制性超促排卵方案、 实验室胚胎培养以及移植技术不断优化为越来越多的家庭带来了希望，但是， RIF 仍是临床工作中的一个难题[9]。目前的研究进展表明，引起RIF的主要因素包括许多方面，主要有宫腔异常或粘连、子宫内膜菲薄、免疫排斥、子宫内膜炎以及黏附分子表达异常等。通过改善子宫内膜容受性、优化胚胎选择、加强胚胎内膜同步化以及优化移植技术等大大提高了RIF患者的胚胎种植率。甾体类激素、抗凝药物、宫腹腔镜手术和内膜搔刮机械刺激等方法都在临床上得到了不同程度的运用，但均有药物不良反应和操作疼痛等缺点。因此，寻找操作更简便、无疼痛、患者依从性更好的治疗方法是目前研究的方向。

越来越多的文献报道，RIF与母胎界面免疫系统的失衡相关，即子宫内膜局部免疫调节存在异常。自体G-CSF宫腔内灌注治疗作为一种新型的技术，在RIF的治疗中越来越受到关注[10]。

本研究共纳入59例拟行冷冻胚胎移植的RIF患者，对照组29例，治疗组30例。其基础年龄、BMI、不孕年限方面均差异无统计学意义(P>0.05)。有研究显示，基础激素水平的差异可能引起妊娠差异，但本研究纳入的研究对象在FSH、LH、E2这三项基本指标方面没有明显区别。两组患者均为反复种植失败患者，我们评估了两组患者的既往情况，发现其在既往平均取卵周期数、平均移植周数、平均移植胚胎数、平均移植优质胚胎数方面均差异无统计学意义(P>0.05)，由此可见，治疗组与对照组在可能影响胚胎移植成功率的因素方面均无明显差别。

其次，我们评估了两组冷冻胚胎移植周期内膜准备方案，二者在人工周期的实施上，并无明显差别，内膜情况亦无明显差异。在进一步评估复苏胚胎的存活率后，我们发现，治疗组与对照组并无明显差别。

最终结果显示，治疗组有16例患者获得临床妊娠，胚胎种植率(23.8%)高于对照组(11.0%)(P<0.05)，临床妊娠率亦显著高于对照组(17.2%)(P<0.05)，提示G-CSF官腔内灌注治疗可能有利于胚胎种植。

G-CSF宫腔内灌注治疗 RIF 的作用机制有待进一步研究。研究发现人子宫内膜和母胎界面均有表达G-CSF受体，人子宫基质CD56+细胞和CD3+细胞均可检测到G-CSF受体[11]。G-CSF是正常妊娠母胎对话中调节子宫内膜免疫细胞功能的重要细胞因子之一，被证明在外源性给人类患者或动物时具有免疫调节作用[12]。

Morris等研究[13]发现小鼠结肠癌模型中，采用anti-GCSF治疗组与对照组相比NK1.1和CD3+细胞增加3倍以上，CD4+T细胞增加5倍，而CD8+细胞增加3倍，阻断G-CSF作用后，白细胞介素(IL)-10明显减少，IL-12增加(IL-12能激活NK细胞活性), γ-干扰素(IFN-γ):IL-10 比例明显增加；穿孔素增加了4.61倍,granzyme B增加了3.14倍。提示anti-GCSF治疗可通过增加NK细胞和CD8+T细胞数量诱导抗肿瘤免疫。同时也有证据提示改变Th1/TH2、CD4+/CD8+T细胞亚群的比值或者有溶解细胞活性。国外学者在糖尿病和移植物抗宿主疾病研究发现G-CSF支持调节T细胞(Tregs)的积累，且G-CSF诱导T细胞产生IL-10[14-17]。Rondelli等证明G-CSF处理的外周血单个核细胞中CD16+、CD56+和CD57+NK细胞的比例显著降低[18]。Jeffrey则发现用G-CSF动员搜集外周血前体细胞时，NK细胞功能改变和NK细胞祖细胞减少，表明添加少量的G-CSF可能会降低体外NK细胞的生长和功能[19]。

Schlahsa等[20]进一步研究发现，在移植物抗宿主疾病的研究中发现，接受G-CSF治疗的移植患者显示NK细胞功能受损和外周血中NK细胞数量减少，G-CSF被证实是一个强有力的NK细胞功能抑制剂。在体外G-CSF被发现是通过下调肿瘤坏死因子-α(TNF-α)产生而影响NK细胞和细胞毒[21]。分子学相关研究为G-CSF临床应用于反复种植失败患者，对其进行免疫干预提供了理论依据[22-23]。

本研究中治疗组共有16个活婴出生，对照组有 5个活婴出生。目前暂未发现该项治疗方法对子代发育有不良影响。两组患者分娩的婴儿均无畸形，但是需要进一步随访G-CSF宫腔内灌注的治疗方法对子代发育是否有影响。

本文结果表明，自宫腔内灌注治疗可提高RIF患者临床妊娠率及胚胎种植率。本研究提示G-CSF宫腔内灌注是治疗 RIF 的有效方法，且操作方便，依从性好， 对RIF患者提高妊娠率具有一定意义。