独活寄生汤对膝骨关节炎大鼠SDF-1/CXCR4信号通路的影响

2020-04-10郑若曦吴广文邱建清刘淑如刘南航

亚太传统医药 2020年1期

郑若曦，吴广文，，陈俊，邱建清，刘淑如，刘南航

(1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州 350122；2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建福州 350122；3.福建中医药大学中西医结合学院，福建福州 350122)

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是在力学和生物学因素等多种因素共同作用下，软骨细胞、细胞外基质、软骨下骨三者降解-合成偶联失衡的结果[1]。前期研究发现骨关节炎呈现出一种涉及免疫的炎症环境[2]和营养缺乏的内质网应激[3]，这种环境是一种持久的障碍，触发了细胞凋亡和新生血管产生。因而，如何克服这种涉及免疫的炎症环境和应激反应可能是有效治疗OA的方法。SDF-1/CXCR4信号通路在免疫调节和炎症反应等方面具有重要作用[4]。

独活寄生汤临床广泛用于膝骨关节炎(Knee Osteoarthritis，KOA)的治疗，疗效可靠[5-10]。前期研究[11-17]表明，独活寄生汤可有效延缓软骨退变，但是否通过调节SDF-1/CXCR4信号通路发挥作用尚不明确。本研究以SD大鼠KOA动物模型为研究对象，通过观察独活寄生汤对SDF-1/CXCR4信号通路相关调节因子的影响，探讨独活寄生汤治疗KOA的作用机制，为其临床应用提供参考依据。

1 材料与试剂

1.1 实验动物

2月龄SPF级SD大鼠，雄性，45只，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号：SCXK(沪)2017-0005。

1.2 主要试剂与仪器

SDF-1、CXCR4、MMP-3、MMP-13一抗(美国abcam公司)；MMP-9一抗(美国cell signaling公司)；二抗(美国Millipore公司)；SDF-1、CXCR4、MMP-3、MMP-9、MMP-13引物(福州尚亚生物技术有限公司)；酶标仪(Thermo Fisher Scientific公司)；ABI实时荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)；蛋白核酸分析仪(美国Beckman Coulter公司)。

2 方法

2.1 分组与模型复制

45只大鼠适应性喂养1周后，随机分为空白组、模型组和治疗组3组，15只/组。空白组不做处理；模型组和治疗组均在1、4、7天双膝关节腔注射4%木瓜蛋白酶复制KOA动物模型[18]。术后2周，治疗组给予独活寄生汤临床等效剂量[19]，按照9.3 g·kg-1·d-1的剂量进行灌胃，空白组和模型组给予等量的0.9%生理盐水灌胃，共治疗8周。

2.2 组织取材与处理

末次灌胃结束后，按照3 mL/kg的剂量腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，膝关节备皮，于髌韧带附着点外上方，用1 mL医用注射器穿刺入关节腔内，注入灭菌生理盐水，反复活动膝关节，抽取关节液，置入EP管中，-80 ℃保存，用于SDF-1检测；随后打开膝关节腔，收集膝关节滑膜组织，保存在液氮中，用于SDF-1 mRNA和蛋白检测；取完滑膜组织后，切取胫骨平台和股骨下端软骨组织，迅速置入液氮中保存，用于CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA和蛋白的检测。

2.3 ELISA法检测关节液中SDF-1含量

取出-80 ℃保存备用的各组关节液，参照试剂盒说明书测定各组样本中SDF-1含量。

2.4 Real-time PCR法检测各组滑膜组织中SDF-1和软骨组织中CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA表达

取出液氮中保存备用的各组滑膜组织和软骨组织，匀浆后，Trizol法提取总RNA；核酸分析仪检测各样本RNA浓度和OD260/280值。根据试剂盒说明书，取1 μg总RNA逆转录成cDNA。以1 μL cDNA为模板扩增SDF-1、CXCR4、MMP-3、MMP-9、MMP-13和GAPDH。以GAPDH为内参照基因，计算各目的基因2-ΔΔCt，比较各目的基因mRNA表达水平。

2.5 Western blot法检测各组滑膜组织中SDF-1和软骨组织中CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13蛋白表达

取出液氮中保存备用的各组滑膜组织和软骨组织，匀浆后，提取各组总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，Western blot法检测SDF-1、 CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13蛋白表达情况。

2.6 统计学分析

3 结果

3.1 独活寄生汤对大鼠关节液中SDF-1含量的影响

模型组大鼠中SDF-1含量较空白组增加，差异具有统计学意义(P<0.01)。采用独活寄生汤治疗后，大鼠关节液中SDF-1含量降低，与模型组相比差异具有统计学意义(P<0.01)。见图1。

注：与空白组相比，a Pb P

3.2 独活寄生汤对大鼠膝关节滑膜组织SDF-1 mRNA和蛋白表达的影响

与空白组相比，模型组大鼠膝关节滑膜组织中SDF-1 mRNA表达升高到(2.601 2±0.086 4)，差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，治疗组大鼠膝关节滑膜组织中SDF-1 mRNA表达降低至(1.907 1±0.046 5)，差异具有统计学意义(P<0.01)。见图2。独活寄生汤对SDF-1蛋白的影响与其对SDF-1 mRNA的影响具有类似的趋势，即与空白组相比，模型组大鼠膝关节滑膜组织中SDF-1蛋白表达升高；经过独活寄生汤治疗后，SDF-1蛋白表达降低。见图3。

注：与空白组相比，a Pb P

3.3 独活寄生汤对大鼠关节软骨组织CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA和蛋白表达的影响

与空白组相比，模型组大鼠软骨组织中CXCR4 mRNA表达升高至(1.501 1±0.02)，MMP-3 mRNA表达升高至(2.263 8±0.089 5)，MMP-9 mRNA表达升高至(2.081 7±0.077 3)，MMP-13 mRNA表达升高至(2.274 1±0.065)，差异均具有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，治疗组大鼠关节软骨组织中CXCR4 mRNA表达降低至(1.228 1±0.105 3)，MMP-3 mRNA表达降低至(1.656 2±0.058 1)，MMP-9 mRNA表达降低至(1.518 6±0.045 7)，MMP-13 mRNA表达降低至(1.518 1±0.098)，差异均有统计学意义(P<0.01)。见图4。独活寄生汤对CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13蛋白表达的影响与其对CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA的影响具有类似的趋势，即与空白组相比，模型组大鼠关节软骨组织中CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13蛋白表达均升高；与模型组相比，治疗组大鼠关节软骨组织中CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13蛋白表达均降低。见图5。

图3 干预后各组大鼠SDF-1蛋白表达情况

注：与空白组相比，a Pb P

4 讨论

骨关节炎(OA)是一种合并滑膜及关节内局部炎症的疾病。滑膜参与关节软骨代谢活动，滑膜体积增加可能伴随软骨降解[20]。Wei L等[21]研究表明滑膜受到刺激后，炎性滑膜可能分泌一些因子，进而诱导软骨细胞释放基质降解酶，从而造成软骨破坏。然而关节滑膜软骨的代谢活动受何种信号通路调节，具体作用机制不明。

基质细胞衍生因子 1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)是骨髓基质细胞产生的CXC类趋化蛋白，最初被认为是由骨髓基质细胞、骨髓内皮细胞等产生[22-23]，后来发现KOA患者关节滑膜细胞也会分泌SDF-1到滑液中[24]，若SDF-1与软骨细胞表面的CXCR4受体结合，就能激活Erk及p38 MAPK等信号通路，从而诱导软骨细胞释放MMP-3、9、13等，进而诱导关节软骨破坏[24-25]。Kanbe等[26]采用ELISA法测定55例KOA患者滑液中的SDF-1浓度，发现患者滑液中SDF-1的含量均高于正常人。Kanbe等[27]发现将SDF-1加入到软骨细胞内会诱导MMP-9和MMP-13的释放，而将SDF-1加入到滑膜成纤维细胞则不会改变MMP-9和MMP-13的浓度。总之，SDF-1/CXCR4信号通路在KOA患者的病理进程中具有重要作用。

本研究发现KOA模型大鼠关节液中SDF-1含量明显高于空白组，经过独活寄生汤治疗后，SDF-1含量降低。进一步采用Real-time PCR和Western blot法，从基因和蛋白两个方面检测滑膜组织中SDF-1的表达情况，结果也发现与空白组相比，KOA大鼠SDF-1表达明显增多，而经过独活寄生汤治疗后SDF-1表达量明显下降。与此同时，本研究同时采用Real-time PCR和Western blot法检测大鼠软骨组织中CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13的表达情况，结果发现与空白组相比，KOA大鼠CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13表达明显增多，经过独活寄生汤治疗后大鼠CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13表达量明显下降。由此推测独活寄生汤可能是通过调节滑膜组织中SDF-1和软骨组织中CXCR4的表达，进而调节软骨组织中MMP-3、MMP-9和MMP-13的表达，起到防治KOA的作用，但是否是唯一途径，尚需要后期研究进一步验证。