基于桥联β-环糊精柱液质联用法测定脐橙中己唑醇对映体

张天赐，王春燕，钟 慧，曾庆丽，李来生

(南昌大学化学学院，江西 南昌 330031)

由于生命物质如蛋白质、生物酶和核酸等均为手性物质，与农药作用时存在高度的立体选择性，这使得农药对映体不仅药效不同，而且毒理和代谢途径常存在明显差异[1]。例如三唑类农药杀菌剂的R-构型杀菌作用强，而S-型杀菌作用弱，且生物降解较慢，残留在土壤、水体和植物中的对映体最终会对人体健康和生殖带来严重影响[2]。因此，应该科学全面地评价手性农药残留对食品安全的影响，并进行对映体含量的监测[3]。

目前，高效液相色谱结合高灵敏度的质谱检测在农药残留监测中的应用日益广泛[4]，手性分离的关键问题是选择合适的分离材料[5]。目前，纤维素类固定相在农药拆分中应用较广，大多在正相色谱条件下拆分[6-7]。环糊精类手性固定相是一类常用的多模式手性固定相，其中包结作用参与手性分离是这类固定相的重要特性[8]。然而由于环糊精空腔较小(～0.65 nm)，所能包结的手性物质有限[9]。近些年来，新型的桥联环糊精固定相得到了快速发展，它能够通过多个环糊精腔体协同包结客体[10]，突破了单个环糊精腔体有限的不足，能快速拆分体积较大，数量更多的手性化合物，这也包括手性农药[11]。

已唑醇属一种常用高效三唑类手性杀菌剂，甾醇脱甲基化抑制剂，用于防治水稻的纹枯病，也用于各种作物和果树的白粉病、锈病、黑星病、褐斑病、炭疽病等[12-13]，其手性结构见图1所示。为此，本文采用实验室制备的新型桥联环糊精柱，建立了一种测定脐橙中已唑醇对映体残留的LC-MS/MS新方法，以满足食品中手性农药监测的需要。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Triple TOF 5600+型液质联用仪(美国AB SCIEX公司)，配有LC30液相色谱系统和Analyst TF 1.7.1数据处理软件；TGL-16C 型高速离心机(上海安亭科学仪器厂)；KQ-100DE 型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；AR124CN型电子天平(精度0.000 1 g，奥豪斯仪器(常州)有限公司)；MS 3型涡旋仪(德国 IKA公司)；HR1853型果汁机(中国飞利浦公司)；Milli-Q超纯水制备装置(美国Millipore公司)。

己唑醇外消旋标准样品(纯度≥99.5%)购于上海农药研究院；甲醇(MeOH)、乙腈(ACN) 和甲酸均为色谱级(美国Tedia公司)；四氧化三铁(Fe3O4)，石墨化炭黑(GCB)、N-丙基乙二胺吸附剂(PSA)购自博纳艾杰尔科技公司(天津)，其它分析纯试剂如无水硫酸镁(MgSO4)，氯化钠(NaCl) 等均购于国药集团上海化学试剂公司，实验用水为超纯水。脐橙样品从南昌市超市中随机购买。

2.2 己唑醇标准溶液的配制

称取一定量的己唑醇外消旋标准品，用甲醇溶解后配制成浓度为400 μg·L-1的储备液，贮存在冰箱中备用(4 ℃)。使用前用甲醇稀释成所需浓度：0.5,1,2,4,8,20 μg·L-1，由于外消旋标准品中含有等量的R-和S-对映体，所以每个对映体的浓度为：0.25,0.5,1,2,4,10 μg·L-1，用滤膜过滤后直接进样分析。

2.3 脐橙样品的前处理

采用改进的QuEChERS 法[14]进行样品前处理，尽可能除去脐橙中的色素、脂、果糖和果酸类等干扰物。将脐橙洗净，切成小块，然后制成果浆，取10 g果浆于小管中，加入10 mL乙腈，涡旋1 min。然后加入1 g NaCl和4 g无水MgSO4，涡旋1 min后离心5 min，静置1 min。将上清液转入含1 g MgSO4的离心管中振摇，静置分层。移取上层清液1 mL于含40 mg 石墨化炭黑(GCB)、50 mg N-丙基乙二胺填料(PSA)、60 mg Fe3O4磁粒，涡旋1 min，静置1 min。用外部磁铁使提取液快速澄清，用滤膜过滤后进样分析。

2.4 色谱和质谱条件

色谱条件：桥联β-环糊精柱(250 mm× 4.6 mm)，流动相为甲醇-0.1%甲酸混合溶液，流速为1 mL·min-1，进样量为2 μL，柱温设为20 ℃。

质谱参数：正离子模式下(ESI+)扫描，毛细管电压+5 500 V，脱溶剂温度650 ℃，一级质谱扫描范围：100～400 m/z，二级质谱扫描范围：60～80 m/z，一级和二级碰撞能量(CE)分别为：10和30 V，定量离子分别为314和70 m/z。

3 结果与讨论

3.1 色谱条件的优化

3.1.1 流动相组成及酸度的选择

为了实现己唑醇对映体的快速分离，首先优化流动相的组成，用常见的甲醇-水、乙腈-水、甲醇-甲酸、乙腈-甲酸作为流动相。实验结果发现4种流动相都能实现己唑醇的完全拆分，但甲醇比乙腈分离度更好，且价格较便宜，本实验选用了甲醇作为有机改性剂。也考察了流动相的酸度对拆分的影响，结果显示pH值的变化对分离的影响不大，考虑到已唑醇属碱性农药，三唑基上多个氮原子易被质子化，有利于提高电喷雾正离子化的效率，从而提高检测的灵敏度，故选用甲醇-0.1%甲酸作为流动相。甲醇的含量对已唑醇的手性分离度有重要影响，随着流动相中甲醇含量的提高，分离度是先升后降，综合考虑分析时间、分离度和检测灵敏度，流动相的最终组成为甲醇-0.1%甲酸(32:68V/V)。

3.1.2 柱温的选择

环糊精手性固定相的空腔结构会受温度的影响，加之温度也会影响到已唑醇保留时间、分离度和柱效，最终影响手性农药的分离效果[14]。实验发现在室温附近可实现完全分离，为便于温度控制，确保己唑醇分离的重现性，本实验将柱温设置为20 ℃。

3.1.3 流速和进样量的选择

除了上述两个主要影响因素外，流动相流速和进样量对分离结果也有一定的影响，为此本文考察了不同流速(0.2～1.2 mL·min-1)的影响。发现流速越高，溶质被洗脱越快，保留时间变短，固定相与溶质间的作用时间缩短，分离度下降；当流速较低时，固定相与溶质能充分作用，但色谱峰会展宽。综合考虑分离度和分析时间，流速设置为1 mL·min-1。同时发现进样量太小，灵敏度低，受背景噪声影响较大；而进样量太大，容易造成柱超载，色谱峰变形(前沿或拖尾)，会影响分离度和峰面积定量的准确性，所以选择一个适中的进样量(2 μL)。

3.2 优化的分离条件

采用实验室自制的桥联β-环糊精柱，以甲醇-0.1%甲酸(32:68V/V)为流动相；柱温为20 ℃；流速为1 mL.min-1；进样量为2 μL；采用一级质谱和二级质谱选择正离子检测，具体的质谱参数见第2.4节所示。在上述优化的色谱条件下，对己唑醇对映体进行手性拆分和定量分析，分析时间均在20 min以内，得到了较满意的实验结果。已唑醇外消旋标准品溶液的色谱图见图2所示。

3.3 实际样品的测定

3.3.1 标准工作曲线的制作

采用第2.3节中配制的己唑醇外消旋标准系列溶液，其中单一对映体浓度分别为0.25,0.5,1.0,2.0,4.0,10 μg·L-1，按上述优化的色谱质谱条件进行测定，对单个对映体的峰面积(y)与相应浓度(x,μg·L-1)进行线性回归，结果如下：

己唑醇第一个对映体：y=7.068×105x-3.052×105r2=0.993 3

己唑醇第二个对映体：y=7.332×105x-3.876×105r2=0.993 0

两个己唑醇对映体在测定的浓度范围(0.25～10 μg·L-1)具有良好的线性关系，按三倍信噪比(S/N=3) 推算出己唑醇的最低检出限为0.017 μg·L-1。

3.3.2 回收率和精密度试验

色谱方法开发出来，最终目的是应用到实际的农产品检测中，由于含有已唑醇的实际样品很难获得。因此本实验在脐橙空白基质中分别添加了一定量的己唑醇外消旋标准品，即得模拟样品。对其进行回收率和重现性试验，以便考察该方法的准确度和精密度。添加了低中高3种浓度水平(1,2,4 μg·L-1) 进行实验，每个浓度水平都进行了5次平行测定，实验结果如下：己唑醇第一个对映体平均RSD为2.12%，平均回收率为94.57%；己唑醇第二个对映体平均RSD为2.28%，平均回收率为92.46%；结果表明该对映体的定量方法有较高的精密度和准确性。添加外消旋已唑醇样品的色谱图见图3所示。

4 结论

采用一种自制的新型桥联β-环糊精柱和简单的流动相可完全拆分己唑醇对映体，并结合高效液相色谱-质谱联用法，能在短时间内(20 min) 快速测定脐橙中已唑醇对映体。该方法简便，重现性好，成本低，实用性较强，可用于果蔬样品中手性农药对映体残留量的检测，为食品安全检测提供了一种新分离材料和快速的LC-MS/MS分析方法。