甲状腺乳头状癌Ki-67、BRAF、Galectin-3的表达与淋巴结转移的关系

许健 张颂 章远江 金科

[摘要] 目的 探討甲状腺乳头状癌Ki-67、BRAF、Galectin-3的表达与中央区淋巴结转移的关系。 方法 将168例甲状腺乳头状癌根据中央区淋巴结转移情况分为淋巴结无转移组（n=76）、淋巴结转移1个组（n=40）、淋巴结转移≥2个组（n=52），采用免疫组化法检测Ki-67、BRAF、Galectin-3在各组中的表达，并进行比较。 结果 Ki-67在淋巴结无转移组中阳性率为51.3%，在淋巴结转移1个组中为72.5%，在淋巴结转移≥2个组中为90.4%。Ki-67阳性率在各组间均有统计学差异（χ2=4.8485、21.3767、5.0336，P均<0.05），且随着淋巴结转移数的增加，阳性率升高（P<0.05）。BRAF在淋巴结无转移组中阳性率为42.1%，在淋巴结转移1个组中为62.5%，在淋巴结转移≥2个组中为82.7%。BRAF阳性率在各组间均有统计学差异（χ2=4.3616、20.9635、4.7808，P均<0.05），且随着淋巴结转移数的增加，阳性率升高（P<0.05）。Galectin-3在淋巴结无转移组中阳性率为73.7%，在淋巴结转移1个组中为90.0%，在淋巴结转移≥2个组中为94.2%。Galectin-3阳性率在淋巴结有转移各组中均较淋巴结无转移组中为高（χ2=4.2516、8.8428，P均<0.05），但在淋巴结转移数不同的两组中无统计学差异（χ2=0.5757，P>0.05）。 结论 甲状腺乳头状癌Ki-67、BRAF、Galectin-3的表达与中央区淋巴结转移密切相关，Ki-67、BRAF、Galectin-3高表达者更易出现淋巴结转移。故Ki-67、BRAF、Galectin-3可作为预测甲状腺乳头状癌淋巴结转移的重要肿瘤标志物。

[关键词] 甲状腺乳头状癌;Ki-67;BRAF;Galectin-3;淋巴结转移

[中图分类号] R736.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）02-0027-04

Relationship between expression of Ki-67，BRAF and Galectin-3 in papillary thyroid carcinoma and lymph node metastasis

XU Jian1   ZHANG Song2   ZHANG Yuanjiang1   JIN Ke1

1.Department of Breast and Thyroid Surgery，No.2 People's Hospital of Changshu City in Jiangsu Province，Changshu 215500，China;2.Changshu Medicine Examination Institute in Jiangsu Province，Changshu   215500，China

[Abstract] Objective To investigate the relationship between the expression of Ki-67， BRAF and Galectin-3 in papillary thyroid carcinoma and lymph node metastasis in central region. Methods One hundred and sixty-eight cases of thyroid papillary carcinoma were divided into the lymph node metastasis=0 group（n=76），lymph node metastasis=1 group（n=40） and lymph node metastasis≥2 group（n=52）according to status of central lymph node metastasis. Immunohistochemistry was applied to determine and compare the expression of Ki-67，BRAF， and Galectin-3 in three groups. Results The positive rates of Ki-67 were 51.3% in the lymph node metastasis=0 group，72.5% in the lymph node metastasis=1 group，and 90.4% in the lymph node metastasis≥2 group. The positive rates of Ki-67 were statistically different among the groups（χ2=4.8485，21.3767，5.0336，P<0.05），and the positive rate was increased with the increase of lymph node metastasis（P<0.05）. The positive rates of BRAF were 42.1% in the lymph node metastasis=0 group，62.5% in the lymph node metastasis=1 group， and 82.7% in the lymph node metastasis≥2 group. The positive rates of BRAF were statistically different among the groups（χ2=4.3616，20.9635，4.7808，P<0.05），and the positive rate was increased with the increase of lymph node metastasis（P<0.05）. The positive rates of Galectin-3 were 73.7% in the lymph node metastasis=0 group，90.0% in the lymph node metastasis=1 group，and 94.2% in the lymph node metastasis≥2 group. The positive rates of Galectin-3 were higher in the groups with lymph node metastasis than in the lymph node metastasis=0 group（χ2=4.2516，8.8428，both P<0.05），but there was no statistical difference in the two groups with different number of lymph node metastasis（χ2=0.5757，P>0.05）. Conclusion The expression of Ki-67， BRAF and Galectin-3 in papillary thyroid carcinoma is closely related with lymph node metastasis in central region. Lymph node metastasis is more likely to occur in patients with high expression of Ki-67，BRAF and Galectin-3. Therefore，Ki-67，BRAF，and Galectin-3 can be used as important tumor markers for predicting lymph node metastasis of papillary thyroid carcinoma.

[Key words] Papillary thyroid carcinoma; Ki-67; BRAF; Galectin-3; Lymph node metastasis

甲状腺癌是临床常见的恶性肿瘤，乳头状癌是甲状腺癌中最常见的类型，恶性程度不高，但易发生淋巴结转移，常首先转移至中央区淋巴结，因此中央区淋巴结转移情况是影响甲状腺乳头状癌预后的重要指标[1]。Ki-67是目前较为肯定的核增殖标志物，与肿瘤细胞的异常增殖关系密切[2]。BRAF与Galectin-3的高表达均预示着肿瘤有较强的侵袭性，与肿瘤的浸润转移密切相关[3，4]。但甲状腺乳头状癌中Ki-67、BRAF、Galectin-3的表达与淋巴结的转移是否有关尚未明确。本研究拟通过免疫组化方法，探讨甲状腺乳头状癌Ki-67、BRAF、Galectin-3的表达情况与中央区淋巴结转移的相关性，从而为预测甲状腺乳头状癌的淋巴转移及预后分析等提供依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年2月～2018年2月我院行中央区淋巴结清扫的甲状腺乳头状癌患者共168例，其中男52例，女116例，年龄21～82岁，平均（42.1±17.8）岁，病程1 d～12年，术前FT3、FT4、TSH、甲状腺过氧化物酶抗体（TPOAb）均在正常范围，术前常规检查排除肿瘤有远处转移或颈侧区淋巴结转移，手术方式为甲状腺癌根治术（甲状腺腺叶切除+中央区淋巴结清扫），术后病理证实均为甲状腺乳头状癌。肿瘤病灶术后常规进行免疫组化检测Ki-67、BRAF、Galectin-3的表达情况，中央区淋巴结术后常规病理检测肿瘤转移情况。所有168例甲状腺乳头状癌病例根据术后中央区淋巴结病理检测肿瘤转移情况分为淋巴结无转移组（共76例）、淋巴结转移1个组（共40例）、淋巴结转移≥2个组（共52例）。本研究获得我院伦理委员会批准及患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化主要试剂  鼠抗人单克隆抗体Ki-67（产品编号：MAB-0672）、兔抗人单克隆抗体BRAF （产品编号：RMA-0839）、鼠抗人单克隆抗体Galectin-3（产品编号：MAB-0783）均购自福州迈新生物技术开发有限公司。SP检测试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司，产品编号：KIT-9720。DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司，产品编号：DAB-4032。

1.2.2 免疫组化检测方法  用10%甲醛溶液固定甲状腺癌标本24 h，然后石蜡包埋，制作4 μm厚连续切片。免疫组化操作步骤：①石蜡切片60℃烤片60 min，脱蜡、水化，PBS浸泡5 min;②3% H2O2室温孵育10 min，蒸馏水冲洗，PBS浸泡;③柠檬酸缓冲液微波抗原修复;④正常山羊血清（PBS稀释至5%）封闭，室温孵育10 min;⑤分别滴加一抗Ki-67、BRAF、Galectin-3， 37℃孵育1 h，然后PBS冲洗3次;⑥滴加适当比例稀释的生物素标记的二抗，37℃孵育10 min，PBS冲洗3次;⑦滴加适当比例稀释的辣根酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育10 min，PBS冲洗3次;⑧显色剂显色（DAB），20 min;⑨自来水充分冲洗，苏木素复染，梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。用已知阳性的组织切片作阳性对照，用PBS液代替一抗作阴性对照。

1.3 免疫组化结果阳性判断

参考Beesley分级[5]方法，按照阳性细胞所占百分比确定免疫组化结果阴性或阳性。具体方法为：每张免疫组化切片随机取4个高倍视野，当细胞质和（或）细胞核见到棕黄色颗粒分布为阳性细胞，计算阳性细胞所占百分比，当阳性细胞数<10%时计为阴性（-），阳性细胞数≥10%时计为阳性（+）。

1.4 观察指标

甲状腺乳头状癌术中常规行中央区淋巴结清扫，观察中央区淋巴结肿瘤转移情况，并根据淋巴结肿瘤转移数目不同分为淋巴结无转移组、淋巴结转移1个组、淋巴结转移≥2个组。采用免疫组化检测方法观察甲状腺乳头状癌病灶中Ki-67、BRAF、Galectin-3的表达情况。观察并分析Ki-67阳性率、BRAF阳性率、Galectin-3阳性率在三组中的高低。

1.5 统计学方法

采用STATA12.0统计学软件进行数据处理，计数资料以[n（%）]表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Ki-67在各组中的表达阳性率比较

Ki-67阳性表达部位位于细胞核，阳性细胞见棕黄色颗粒分布。Ki-67在本组甲状腺乳头状癌中总的陽性率为68.5%，在淋巴结无转移组中的阳性率为51.3%，在淋巴结转移1个组中的阳性率为72.5%，在淋巴结转移≥2个组中的阳性率为90.4%。Ki-67的阳性率在淋巴结有转移各组中均较淋巴结无转移组中为高（P<0.05），并且随着淋巴结转移数目的增加，阳性率升高（P<0.05）。见表1。

2.2 BRAF在各组中的表达阳性率比较

BRAF阳性表达部位位于细胞质，阳性细胞见棕黄色颗粒分布。BRAF在本组甲状腺乳头状癌中总的阳性率为59.5%，在淋巴结无转移组中的阳性率为42.1%，在淋巴结转移1个组中的阳性率为62.5%，在淋巴结转移≥2个组中的阳性率为82.7%。BRAF的阳性率在淋巴结有转移各组中均较淋巴结无转移各组中为高（P<0.05），并且随着淋巴结转移数目的增加，阳性率升高（P<0.05）。见表2。

表2   BRAF在各组中的表达阳性率比较

注：1）淋巴结转移1个组BRAF阳性率与淋巴结无转移组相比：χ2=4.3616，P=0.037;2）淋巴结转移≥2个组BRAF阳性率与淋巴结无转移组相比：χ2=20.9635，P=0.000;3）淋巴结转移≥2个组BRAF阳性率与淋巴结转移1个组相比：χ2=4.7808，P=0.029

2.3 Galectin-3在各组中的表达阳性率比较

Galectin-3阳性表达部位位于细胞质，阳性细胞见棕黄色颗粒分布。Galectin-3在本组甲状腺乳头状癌中总的阳性率为83.9%，在淋巴结无转移组中的阳性率为73.7%，在淋巴结转移1个组中的阳性率为90.0%，在淋巴结转移≥2个组中的阳性率为94.2%。Galectin-3的阳性率在淋巴结有转移各组中均较淋巴结无转移组中为高（P<0.05），但在淋巴结转移数目不同的两组中无统计学差异（P>0.05）。见表3。

表3   Galectin-3在各组中的表达阳性率比较

注：1）淋巴结转移1个组Galectin-3阳性率与淋巴结无转移组相比：χ2=4.2516，P=0.039;2）淋巴结转移≥2个组Galectin-3阳性率与淋巴结无转移组相比：χ2=8.8428，P=0.003;3）淋巴结转移≥2个组Galectin-3阳性率与淋巴结转移1个组相比：χ2=0.5757，P=0.448

3 讨论

异常增殖与转移复发是恶性肿瘤的特征，甲状腺乳头状癌是临床常见肿瘤，一般预后较好，但易出现淋巴结转移。甲状腺乳头状癌的成功治疗主要依赖早期诊断、合适的手术和术后相关治疗。研究表明，明确肿瘤的生物学信息，对于恶性肿瘤的诊断、治疗和预后判断有着极为重要的意义[6，7]。

Ki-67抗原最早是1983年由德国学者Gerdes在霍奇金淋巴瘤源性细胞系中使用鼠单克隆抗体抗核抗原的研究中发现，随后以Gerdes所在学校名称Kiel University命名，其在细胞周期的G1期开始表达，在S期和G2期表达增加，在M期达到高峰，有丝分裂结束后迅速降解，且不表达于DNA修复状态的细胞，是目前较为肯定的核增殖标记物，被认为是较理想的代表细胞增殖活性的抗原[8，9]。Ki-67蛋白的表达可反映肿瘤细胞活性，与恶性肿瘤的发展、转移和预后高度相关[10]。中央区淋巴结是甲状腺淋巴引流的第一站，是甲状腺乳头状癌最易转移的部位，甲状腺癌根治术一般都要清扫中央区淋巴结，因此中央区淋巴结转移情况便成为甲状腺乳头状癌治疗及预后判断最重要的指标之一，但甲状腺乳头状癌中Ki-67的表达与中央区淋巴结转移是否有关尚未明确。本研究结果显示，甲状腺乳头状癌Ki-67表达水平与中央区淋巴结转移情况密切相关（P<0.05），Ki-67的阳性率随着淋巴结转移数目的增加而升高（P<0.05）。分析其中原因，认为肿瘤淋巴结转移是与肿瘤细胞的增殖活性密切相关的，Ki-67是与细胞增殖相关的核抗原，故Ki-67高表达者肿瘤细胞增殖快，恶性度高，更易出现淋巴结转移。

BRAF又名鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1，是RAF基因家族的成员之一，位于人染色体7q34，BRAF是RET和RAS的下游蛋白激酶。BRAF是目前研究较热的癌基因，BRAF在甲状腺乳头状癌中表达率达50%，但在甲状腺良性肿瘤中不表达[11，12]，这与本实验结果BRAF阳性率59.5%相比稍低。有研究报道在肠癌中BRAF高表达的肿瘤细胞侵袭力强，容易浸润周围组织，临床病理分期高[13]。与之相似，BRAF在甲状腺乳头状癌的生长、浸润和转移过程中也可能发挥着重要作用。由本研究可知，BRAF阳性率在无淋巴结转移组、淋巴结转移1个组、淋巴结转移≥2个组中分别为42.1%、62.5%、82.7%，随着淋巴结转移数的增加，BRAF阳性率升高（P<0.05）。因此，BRAF高表达的甲状腺乳头状癌确实预示着更高的侵袭性，更易出现淋巴结转移。

肿瘤细胞的黏附性在侵袭和转移中起着极为重要的作用。分子水平的研究显示，Galectin-3与肿瘤分化、侵袭能力密切相关[14]。Galectin-3中文名半乳糖凝素3，是一個31 kD的β半乳糖蛋白，属于植物血凝素家族，位于染色体1p13，是一种细胞凝集素，主要与细胞内的糖蛋白、细胞表面分子和胞外基质蛋白作用，可调节肿瘤细胞增殖、黏附、侵袭和凋亡[15]。有报道甲状腺乳头状癌中存在强且弥漫性的Galectin-3免疫组化染色，良性甲状腺结节Galectin-3表达很低，而正常甲状腺组织未检测到Galectin-3的表达[16，17]，这与本研究中甲状腺乳头状癌Galectin-3总的阳性率高达83.9%是一致的。Galectin-3高表达的肿瘤细胞往往预示着更高的侵袭性，易发生转移。由本研究可知，Galectin-3的阳性率在淋巴结有转移的两组中均较淋巴结无转移组中为高（P<0.05），但在淋巴结转移数目不同的两组中并无统计学差异（P>0.05）。分析产生这一结果的原因可能是：①甲状腺乳头状癌中Galectin-3的表达增多，分布于整个细胞表面，增强了肿瘤细胞与基底膜和基质的黏附，促进肿瘤细胞向基底膜和基质浸润，使肿瘤细胞的迁徙能力增强，故更易出现淋巴结转移;②本研究中淋巴结转移数目不同的两组中Galectin-3的阳性率并无统计学差异（P>0.05），这可能与样本量较少有关，需进一步扩大样本量并从基因水平进行研究。

综上所述，甲状腺乳头状癌Ki-67、BRAF、Galectin-3的表达情况与中央区淋巴结转移密切相关。甲状腺乳头状癌Ki-67、BRAF、Galectin-3高表达者更易出现淋巴结转移，肿瘤细胞恶性程度更高，术后更易出现复发转移，因此这类甲状腺乳头状癌患者在术后的激素抑制治疗中TSH应该控制在更低的水平，从而降低肿瘤的复发几率，且应该更加密切的随访复查，一旦发现肿瘤转移复发可及时治疗。因此，在甲状腺乳头状癌的临床诊治中，检测Ki-67、BRAF、Galectin-3有助于了解肿瘤的转移倾向，评估肿瘤的生物学行为及预后，对指导治疗和提高疗效有重要意义。

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（收稿日期：2019-09-19）