内源性神经干细胞治疗多发性硬化的研究进展

2020-04-09陈武龙徐君铭王淑芬

昆明医科大学学报 2020年3期

周舒，陈武龙，徐君铭，王淑芬

（昆明医科大学分子临床医学研究院暨云南省干细胞和再生医学重点实验室，云南昆明 650500）

多发性硬化症（multiple sclerosis，MS）是以中枢神经系统炎性脱髓鞘为主要病理特征的自身免疫性疾病，是世界范围内青壮年常见的非创伤性、致残性神经系统疾病[1]。在全球范围内有超过250万患者，且女性罹患MS 风险远高于同龄男性[2]。目前尚不清楚多发性硬化的发病诱因，流行病学调查表明，MS 是由遗传、环境等因素相互作用的结果，是具有多因素起源的由免疫介导的异质性疾病[3]。基于全基因组关联研究，230 余种遗传变异与MS风险增加相关，且大多数变异都为免疫相关基因，高纬度、维生素D 缺乏、EB 病毒感染、抽烟均可增加MS 的易感性[4]。长久以来，MS 的治疗一直面临巨大的挑战，目前临床上没有靶点药物和针对性的治疗方法，应用于MS 的治疗药物最佳应用窗口期非常短暂，且通常价格高昂，最重要的是这些药物均无法从根本上阻止疾病进展也不能逆转患者躯体运动和感觉功能障碍[1]。

1 多发性硬化症的髓鞘再生和神经保护治疗

MS 病理生理学机制目前尚未完全明确，慢性和反复发作的炎性反应可能干扰神经细胞和轴索环境的稳态，通过影响离子通道活性、引起线粒体损伤和氧化应激损伤等机制，引起患者CNS 灰质及白质内髓鞘脱失的广泛发生[5-6]。髓鞘是中枢神经系统中由少突胶质细胞包绕神经元轴突形成的多层脂膜结构，为轴突提供营养和代谢支持，是神经电信号得以高速准确传导的基础并与神经可塑性息息相关。髓鞘的脱失使得轴突非常脆弱，如果轴突不能及时被髓鞘重新包裹，可发生变性坏死[7]。中枢神经系统脱髓鞘性疾病发生后，机体通常迅速启动内源性修复机制，MS 患者脑组织尸检病理结果证明髓鞘再生现象是普遍存在的，在MS 急性期与慢性期病灶中均可发生[8]。由进一步的研究表明，病灶中髓鞘再生的比例随着疾病的进展而降低，慢性病灶的髓鞘再生现象通常仅限于病灶周边区域[9]。随着病程的进展，机体自发性的髓鞘再生效率衰减、神经元轴突退变持续累积，是MS 患者进行性的、不可逆的神经功能障碍的根本原因[10]。而综合分析MS 患者临床表现、影像学特征和实验室检查结果发现，MS 患者自发性髓鞘再生的程度存在很大个体差异，髓鞘再生水平高的患者神经功能障碍程度较轻，表明MS 神经功能恢复很大程度依赖于内源性修复机制的动员[11]。而MS 中枢神经损伤修复的关键在于成体中枢神经系统少突胶质细胞的增殖分化及其介导髓鞘再生修复。迄今为止普遍认为髓鞘再生主要由少突胶质细胞前体细胞（oligodendroglial precursor cells，OPCs）介导，可能由于MS 慢性脱髓鞘区域内存在多种OPCs 分化相关抑制剂，病变部位检出大量无法分化为成熟髓鞘化OLs 的OPCs[4]。此外，成体中枢神经系统内神经干细胞在促进髓鞘再生方面同样蕴含巨大潜力。

2 内源性神经干细胞参与髓鞘再生修复

在过去数10 a 中，在成年中枢神经系统的特化区域发现了内源性的NSCs，其自我更新和多向分化的潜能贯穿终生[13]，对于神经系统的发育、神经组织稳态的维持和损伤的修复至关重要。MS 中枢神经系统髓鞘脱失造成的神经损伤可迅速启动内源性修复机制，CNS 中活化的NSCs 可增殖、启动分化程序迁移至损伤部位替换损伤的髓鞘化OLs。部分研究表明，病灶区检测的衍生自NSCs的OLs 数量高于衍生自OPCs 的OLs 数量。并且NSCs 介导的新生髓鞘具有正常厚度，而OPCs 介导的髓鞘再生髓鞘较薄[14]。此外，NSCs 还可通过分泌神经营养因子及抑制神经再生阻碍因子等作用使髓鞘脱失的神经纤维以及新生的神经纤维包绕髓鞘，从而重构神经结构，促使患者运动、感觉功能得到不同程度的恢复[15]，这些研究成果为通过内源性神经干细胞途径治疗MS 提供基础理论支持。

NSCs 在胚胎发育早期主要存在于神经管的神经上皮[16]。在成体哺乳动物中枢神经系统中，NSCs大多数位于侧脑室的室管膜下区（subventricular zone，SVZ）和海马齿状回（dentate gyrus，DG）的亚颗粒层区域（subgranular zone，SGZ）[16]。SVZ区是成体最大的NSCs 生发区，其中大多数NSCs处于静止状态，同时表达CD133（Prominin-1）和GFAP。这些静止的NSCs 又被称为静息神经干细胞（quiescent NSCs，qNSCs）或B1q 型细胞，当其自身或环境的信号发生变化时，能够响应这些变化而被激活产生表达表皮生长因子受体（EGFR）的增殖性活化型神经干细胞（activated NSCs，aNSC），又称为B1a 型细胞（GFAP+CD133+EGFR+）。B1 型细胞和室管膜细胞（Ependymal E cells）交错排列构成了风车样结构的侧脑室外侧壁。被激活的NSCs 可依次产生神经祖细胞（Neural progenitor cells，NPCs 或Transit-amplifying cells，TACs 或C型细胞）。C 型细胞（GFAP-EGFR+）增殖旺盛，可分化为表达唾液酸-神经细胞黏附分子（PSA-NCAM）的A 型神经母细胞（Neuroblast A cells）。A 型细胞可沿一条高度局限的通道——吻侧迁移流（rostral migratory stream，RMS）迁移至嗅球（olfactory bulb，OB），随后分化为中间神经元并整合入神经回路。此外，SVZ 区NSCs 还可以增殖迁移至周围区域（例如胼胝体、纹状体）分化产生能形成髓鞘化OLs。成体海马SGZ 区的NSCs 通常处于静息或休眠状态，通过不对称分裂形成放射状状星形胶质细胞。放射状星形胶质细胞能够快速增殖、并从颗粒下层向颗粒层迁徙逐步成熟形成谷氨酸能海马齿状回颗粒神经元[18]。

多项研究证实，脱髓鞘改变诱使SVZ 区NSCs向OLs 方向分化的比例大幅增加，胼胝体、纹状体及穹窿海马伞均发现了由NSCs 介导的自发性的髓鞘再生现象[19]。而相同情况下，SGZ 区的NSCs似乎仅能分化形成神经元，在对其进行基因重编程或营养因子处理之后才可分化形成OLs[19]。在这种自发性的损伤修复过程中，内源性NSCs 增殖与分化的命运决定受到诸多因素制约，在缺乏任何外源性干预的情况下，髓鞘化OLs 生成效率较低、组织重建和修复非常缓慢甚至停滞、难以有效逆转MS 患者的病情进展。通过药物治疗或其他手段干预，可以激活、募集内源性NSCs，并诱导其有效发挥神经修复作用，且与外源性细胞移植相比，可以避免免疫排斥、伦理纠纷和肿瘤形成的风险，是最接近于临床应用的治疗方法，故采用外源干预措施动员内源性NSCs 进行髓鞘修复再生，已成为延缓、预防或逆转MS 进展最合适的前景之一[21]。现就内源性NSCs 在中枢神经系统髓鞘修复再生的研究进展进行综述，为潜在的医疗制药方面提供了可供参考的思路。

3 细胞外信号调控神经干细胞髓鞘再生修复的分子机制及调控靶点

神经干细胞命运维持和重塑取决于多种细胞内在机制及其与微环境的动态相互作用[22]。神经干细胞微环境（Niche）是一个高度复杂的、能够发生动态变化的NSCs 生活微生态系统，包括可溶性的信号分子、粘附信号分子、细胞间的相互作用、细胞与胞外基质之间的相互作用、构成微生态立体结构的机械力以及代谢产物、氧气等理化因素。不同发育时期特定细胞群体的转录组测序分析表明，NSCs 与微环境细胞具有协同发育和共享基因表达的特点[23]，血管内皮细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞、室管膜细胞、神经干细胞及其子代细胞是神经微环境的主要细胞组分。

固有免疫及适应性免疫应答及相关的炎症反应是MS 重要的病理基础[1，23]，在MS 进行性的神经退变中也发挥重要作用。对于NSCs 介导的内源性损伤修复过程中，免疫细胞与NSCs 及其子代细胞的相互作用对后者的命运及功能整合起决定性作用[24]。MS 患者机体CNS 中慢性和反复发作的炎性反应可激活神经干细胞Niche 中的小胶质细胞和星形胶质细胞[25]，二者释放的促炎因子及细胞毒性物质可募集辅助性T 细胞17（Thy17）等免疫细胞浸润，既对Niche 的结构和功能造成巨大影响，又直接作用于NSCs、影响内源性的再生修复过程[26]。有研究表明脑内小胶质细胞和Th17 细胞的浸润协同促进MS 脑内髓鞘损伤[27]。Th17 细胞和调节性T细胞（Treg）均由初始CD4+细胞分化而来，Th17细胞能够分泌促炎症因子IL-17，Treg 则是机体免疫耐受得以维持的重要保证，二者的平衡对于自身免疫性疾病的治疗具有重要意义。加州大学的研究人员发现一种小分子化合物可以促使Th17 细胞分化为诱导型调节性T 细胞（iTreg），使用这种药物促进了实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠的髓鞘再生[28]。最近研究发现，阿司匹林通过IL-11 促进Treg 稳定性并改善EAE 小鼠髓鞘再生，缓解了疾病的进展[29]。在MS 适应性和先天性免疫反应过程中，活化的星形胶质细胞可分泌炎性因子TNF-α、IL1β 和IL6[29]；神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）、血管内皮生长因子（VEGF）和白血病抑制因子（LIF）表达上调[31]。LIF 可对TNF-α 诱导的少突胶质凋亡发挥保护作用，且这一保护作用呈剂量依赖性[32]。星形胶质细胞表达BMP 配体及其受体，BMP4 信号可以诱导NSCs 分化为星形胶质细胞。脱髓鞘过程中在脑室内注射BMP4 拮抗剂Noggin 后，髓鞘化OLs 数量以及髓鞘再生程度显著上升[33]。在脑室注入另一种BMP 抑制剂Chordin，可使得原本向嗅球成神经细胞方向分化的NSCs，转为分化生成OLs[34]。MS 患者活动性病灶和伴有组织坏死和胶质瘢痕病灶中的星形胶质细胞中EGFR 的表达均上调，表明EGF 信号传导与星形胶质细胞增生和神经胶质瘢痕形成有关[35]。应用抗EGF 抗体治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）动物，可显著促进其神经发生和OLs 的生成[36]。同样的，成纤维细胞生长因子（FGF2）注射入侧脑室后，不仅调动了NSCs 的增殖，而且可以诱导NSCs 分化为OLs[37]。

小胶质细胞作为CNS 固有免疫反应的主要介质，其在MS 损伤修复过程中具有双重作用，一方面促进髓鞘再生修复，另一方面致使神经退变。小胶质细胞的吞噬过程是清除神经系统内凋亡细胞、髓鞘碎片等物质的主要途径[38]。抗炎细胞因子如白细胞介素-4（IL-4）和白细胞介素-13（IL-13）可诱导小胶质细胞向M2 方向极化。M2表型小胶质细胞通过分泌转化生长因子-β（TGF-β），IL-10 和精氨酸酶-1（Arg-1）等多种抗炎介质，促进损伤后髓鞘再生[39]。过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARγ）是一类由配体激活的核转录因子，是核受体超家族中的成员之一。在神经再生过程中，M2 小胶质细胞分泌的IGF-1 和TGF-β1 通过PPARγ 介导的信号途径推动NSCs向OLs 的分化，从而促进髓鞘再生[40]。而在MS 炎症环境、或细菌脂多糖（LPS）、干扰素-γ（IFN-γ）等促炎因子诱导下，小胶质细胞可以迅速激活并伴随表型极化。在MS 活跃期，小胶质细胞极化为M1 型，细胞分泌因子发生显著变化，一氧化氮合酶（iNOS）表达显著上升，胞内活性氧簇（ROS）积聚，还可分泌白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和补体C1q（Complement 1 subunit q，C1q）等促炎因子以及多种趋化因子。MS患者机体髓鞘脱失与轴突损伤涉及氧化应激和神经免疫炎症反应机制[24]。iNOS 经炎症介质刺激可催化生成大量一氧化氮（NO）。体内体外实验均显示，SVZ 区NSCs 暴露于一氧化氮（NO）中会使其神经元限制性沉默因子（NRSF/REST）表达水平上调，从而诱导NSCs 分化生成为OLs，但抑制了神经元的生成[41]。Nrf2 是调控细胞氧化应激反应的重要转录因子，同时也可以调节促炎因子，在神经炎性反应中发挥神经保护作用。有研究表明，ROS介导的氧化应激增加可诱导衍生自NSCs 的OLs 生成，而这与Nrf2 表达上调有关[42]。以Nrf2 为靶点的MS 治疗药物富马酸二甲酯于2013 年被FDA 批准为治疗复发型多发性硬化患者的一线药物。MS早期鞘内注射美满霉素可通过抑制M1 型小胶质细胞的活化，来增加NSCs 的增殖及其在SVZ 区分化成熟为髓鞘化OLs 的能力。

血管内皮细胞通过分泌血管内皮细胞生长因子（VEGF）、鞘氨醇-1-磷酸（S1P）、β-细胞素（BTC）等细胞因子以及一些细胞外基质成分，对NSCs 增殖分化以及命运决定调控发挥重要作用[42-43]。MS 患者室管膜细胞和脉络丛上皮细胞可分泌脑脊髓液中众多重要的信号因子，例如TGFs，IGFs，PDGFs，SHH（sonic hedgehog，SHH），WNTs（Wingless/integrated）和BMPs 等，均可作用于神经干细胞的增殖和分化[44]。在体外培养成体NSCs 时，在培养基内加入睫状神经营养因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）后，分化为OLs 的NSCs 比例大量增加。CNTF 属于IL-6 家族的神经营养分子，在MS 动物模型中的研究表明，CNTF可以通过激活JAK-STAT 信号通路诱导在脱髓鞘病灶区NSCs 的髓鞘再生修复，并且对成熟的OLs 发挥神经保护作用[45]。

随着MS 患者年龄的增长，外在微环境的改变相对内在因素对NSCs 命运决定过程具有更加重要的调控作用，主要包括循环代谢物改变和炎症的增加[46]。机体的衰老致使CNS 发生炎症浸润[22]，NSCs周围微环境（Niche）来源的炎症信号促使NSCs 转入静息态，通过抑制WNT 信号通路拮抗剂sFRP5的活性可促进NSCs 的活化增殖，增加神经元及OLs 的分化[47]。Richard Reynolds 等[48]研究显示，即使80 岁MS 患者SVZ 区的NSCs 分化生成OLs 的能力仍然完好无损。这项研究表明，MS 患者反复发作的炎症反应不一定会限制其内源性NSCs 分化形成OLs 的能力。

通过单细胞转录组测序技术对SVZ 区NSCs 的转录组进行分析，揭示了SVZ 区内NSCs 存在胚胎起源、谱系分化和空间的异质性[49-50]。腹侧SVZ 区NSCs 通常分化产生嗅球区的成神经细胞，背侧SVZ 区NSCs 则具有分化生成少突胶质谱系细胞的潜力[51]。且背侧SVZ 区NSCs 在脱髓鞘动物模型中相较于腹侧区显示出更强的增殖、分化与髓鞘再生修复能力。现已证明WNT/β-catenin 信号转导通路对于调控成体背侧SVZ 区NSCs 的谱系分化发挥主要作用[52]。糖原合酶激酶3β（GSK3β）可以通过磷酸化β-catenin 起到对WNT 信号通路抑制的作用。脑室内注射GSK3β 特异性抑制剂可促进化学诱导的脱髓鞘后髓鞘再生[53]。

4 细胞内信号调控神经干细胞髓鞘再生修复的分子机制及调控靶点

神经干细胞微环境内的信号转导触发信号级联反应，从而激活细胞内调节机制，包括转录因子、表观遗传修饰和代谢等。静息态NSCs 的活化是中枢神经系统稳态维持和神经再生的重要过程，涉及表观调控、转录激活、RNA 加工、蛋白质合成、DNA 复制、线粒体生成以及代谢途径的转变等。伴随年龄增长，NSCs 往往可出现多种内在机制的变化，衰老NSCs 可发生端粒耗损、线粒体功能损伤、蛋白质稳态失衡及溶酶体自噬功能等一系列细胞内代谢调控的改变，致使其静息态的维持与退出过程发生紊乱，表现为NSCs 的增殖和自我更新水平显著下降，神经元生成大幅减少[54]。然而，NSCs的少突胶质生成基本上不受衰老的影响[55]，但仍无法弥补MS 患者髓鞘再生的不足。通过重新激活老年小鼠SVZ 区NSCs 端粒酶活性，或者激活衰老静息态NSCs 内溶酶体，均可显著增加神经生成和髓鞘化OLs 的生成[56，16]。

调节转录表达网络对于NSCs 多能性和自我更新的维持举足轻重。WNT/β-catenin 信号通路可以调控细胞周期，在神经系统发育的过程中起关键作用，它参与了神经干细胞的增殖、分化、空间分布的调节等重要过程。p57kip2 是一种细胞周期抑制因子，可抑制NSCs 的增殖。抑制NSCs 中p57kip2 的表达后，NSCs 可迅速大量扩增，且OLs生成比例大幅提高。此外，将抑制p57kip2 表达的SGZ 区NSCs 移植入成体脊髓中后大部分可分化为OLs[57]。SVZ 背侧可检测到WNT 信号通路下游信号靶标Prox1，该转录因子可驱动背侧SVZ 区NSCs向OLs 分化[58]。而Prox1 蛋白在成体海马DG 区扮演着不同的角色，是确保齿状回正常发育以及成体NSCs 分化为颗粒细胞的关键因子[59]，故可抑制DG区NSCs 向OLs 的分化，这表明神经干细胞的增殖分化等行为高度依赖于其生长的微环境。Gli1 蛋白为SHH 信号通路末端的转录因子，研究者表明它以独立于SHH 的抑制作用决定了NSCs 的命运选择[60]。用药理学手段或者基因干预手段抑制Gli1 表达，显著地促进了NSCs 的增殖、OLs 的分化及成髓鞘作用[60]。与Gli1 相似，Sirt1（NAD+依赖的去乙酰化酶Sirtuins 家族成员）的失活增强了NSCs向OLs 的分化和生成[61]。在NSCs 特异性Sirt1 失活的MS 动物模型中，Sirt1 的失活提高了髓鞘损伤时的髓鞘再生速率，并改善了MS 小鼠模型的临床表现。同样的，Pbx1 蛋白是神经发生的正调控因子，它可以促进成体SVZ 区NSCs 向神经元的分化，但它的缺失则诱使NSCs 向OLs 分化[62]。对神经祖细胞的基因表达谱分析表明，核因子Ⅰ（the nuclear factorⅠ，NFⅠ）家族基因在神经胶质祖细胞中特别表达。核因子ⅠX（nuclear factor 1 X-type，NFⅠX）是NFⅠ转录因子家族的成员之一，是一种调节NSCs 活性同时也是调节NSCs 分化的重要因子体内体外实验证实，NFⅠX 存在时SVZ 区NSCs 向OLs 分化的能力下降。而NFⅠ家族另一种转录因子NFⅠB（nuclear factor 1 B-type）则是成体海马DG 区NSCs 分化为OLs 所必需的转录因子，不过Drosha 的存在使得NFⅠB 的mRNA 发生降解，所以阻断了成体海马DG 区NSCs 向OLs 方向的发育[19]。转录因子Ascl1 在神经发育中起关键作用，是转录因子家族bHLH 中重要成员之一。通常SGZ区干细胞仅分化为神经元，利用慢病毒使Ascl1 在SGZ 区NSCs 中特异性的过表达，可诱导SGZ 区NSCs 分化产生OLs[63]，并且使得由白喉毒素（diphtheria toxin，DT）诱导的海马区脱髓鞘重新髓鞘化[64]。而另外一个bHLH 转录因子家族中重要成员少突胶质细胞系转录因子2（Olig2）在SGZ 区NSCs 的过表达也可诱导其分化为髓鞘化OLs[65]。Zfp488 是少突胶质细胞特异的锌指转录因子，其表达模式与髓鞘基因类似，体内体外实验显示，表达Zfp488 的NSCs 可以分化形成髓鞘化OLs[66]。

5 总结与展望

虽然目前对于多发性硬化的治疗没有根本性的治疗方法，但免疫调节药物的应用可以有效降低复发率、延缓疾病的恶性进展。神经干细胞的发现，改变了以往认为成年哺乳动物中枢神经系统的神经细胞不能再生的观念。NSCs 广泛分布于中枢神经系统中，在病理状态下具有神经谱系多向分化潜能，已成为MS 神经损伤修复和再生研究的热点。临床上通过细胞移植来治疗MS 存在诸多因素的限制，而采用外源干预措施促进MS 患者脑内固有神经干细胞增殖是一种较为稳妥和安全的方法。NSCs 介导的髓鞘再生修复是由内在细胞信号和外在微环境调节的复杂生物过程，本文总结了内源性NSCs 维持自我更新和决定谱系分化中的关键调控因子（图1），这些结果为基于内源性NSCs 的MS 治疗策略提供了许多有希望的潜在治疗靶点，需要更加系统深入探索验证以将潜在靶点转化为药理学备选。