胃复方含药血浆对人胃癌BGC-823细胞增殖及垂体瘤转化相关基因表达的影响❋

张顺荣，李东芳，何寄琴，焦 蕉，唐继云，李玉明，何 欣，周 珉，吴 鸿

(1. 广西国际壮医医院，南宁 530201； 2. 中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院，长沙 410013；3. 长沙市第八医院肿瘤科，长沙 410100； 4. 衡阳市中医院，湖南 衡阳 421000)

我国胃癌的发病率呈不断上升趋势[1]。据国家癌症研究机构报告，2012 年中国胃癌发病率和死亡率分别位于全球第5、6位，发病例数和死亡例数分别占全球胃癌发病和死亡的42.6% 和45.0%[2]。胃癌目前的治疗现状虽取得一定进展，但对于中晚期胃癌总体疗效仍不容乐观，因此开发新药及探索多学科治疗模式成为必然。中医药在中晚期胃癌治疗中协同放化疗增效减毒或通过扶正祛邪，改善症状，延长患者生存期，成为一种重要的替补治疗。

胃癌的发生发展机制复杂，涉及多因素、多步骤、多基因突变，导致细胞恶性增殖和无序凋亡，其中细胞恶性增殖是肿瘤发生的生物学基础，因此有效抑制肿瘤细胞的增殖是研究抗肿瘤药物的关键。胃复方是临床治疗胃癌的经验方，通过前期研究发现，胃复方抑制裸鼠移植瘤的生长与下调垂体瘤转化基(pituitary tumor transforming gene,PTTG)、骨髓细胞瘤病毒(cellular-myelocytomatosis viral oncogene, c-Myc)、人端粒酶逆转录酶 (human telomerase reverse transcriptase, hTERT)基因表达有关。为进一步证实其作用机制设计本实验，观察胃复方含药血浆对人胃癌BGC-823细胞增殖及PTTG相关基因及蛋白表达的影响，为胃复方治疗胃癌提供理论依据。本实验开展获得中南大学湘雅医院附属肿瘤医院动物伦理委员会审批。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与细胞株 SD SPF级大鼠30只，体质量(200±20)g，雌雄各半，购自湖南省长沙市天勤生物技术有限公司(使用许可证号SYXK(湘)2014—0016，生产许可证号SCXK(湘)2011-0003)。人胃癌BGC-823细胞株购自武汉博士德公司，用含10%FBS、青霉素100 U/mL、链霉素100 mg/L的RPMI-1640培养基，于饱和湿度培养箱中培养(37 ℃，5%CO2)，按1∶2进行传代培养，取对数生长期的细胞用于实验。

1.1.2 药物与试剂 氟尿嘧啶注射液(10 ml 0.25 g，产品批号FA150611)，上海旭东海普。1640培养基(Hyclone)、胎牛血清(FBS)(Gibco)、胰酶消化液(碧云天)、DMSO(国药集团)、MTT试剂盒(美国Sigma公司)、细胞周期试剂盒(凯基生物)、Trizon Reagent、超纯RNA提取试剂盒、HiFiScript cDNA、UltraSYBR Mixture(CWBIO 康为世纪)。

1.1.3 主要设备与仪器 台式冷冻离心机(中国深圳黑马)、多功能酶标分析仪(汇松)、恒温培养箱(光明)、超净工作台(北京亚泰隆)、倒置显微镜(北京中显恒业仪器)、正置荧光显微镜(Motic)、荧光PCR仪(伯乐生命医学产品(上海)有限公司)。

1.1.4 中药混悬液 胃复方组成：黄芪、党参、白术、茯苓、香附、郁金、苏木、莪术、蚤休、半枝莲、女贞子、菟丝子、白花蛇舌草、甘草、鸡内金、炒麦芽、炒谷芽共200 g。所有生药购自湖南省肿瘤医院中药房，并经湖南中医药大学药学院教研室鉴定，常规水煎水浴浓缩至生药含药量0.6 g/ml，灌装灭菌置于4 ℃冰箱中备用。

1.1.5 含药血浆的制备 将SD大鼠按随机数字表法分成5组，分别为空白对照组、胃复方高剂量组1.8 g/ml(相当于人临床用药量的4倍)、中剂量组0.9 g/ml(相当于人临床用药量的2倍)、低剂量组0.45 g/ml(相当于人临床用药量)、5-Fu阳性对照组各6只。中药组灌胃每次2 ml，每日2次(9 am，4 pm)，连续7 d。空白对照组灌服等量生理盐水，西药对照组每日按4 mg/200 g 5-Fu腹腔注射，隔日1次，连续4次。各组末次给药后2 h，用5%水合氯醛麻醉后腹主动脉采血，同组大鼠的血液混匀后合装于肝素抗凝管，经3000 r/min离心，10 min后收集血浆，0.22 μm滤膜过滤，56 ℃水浴灭活30 min，分装置-20 ℃冰箱备用。

1.2 方法

1.2.1 MTT法检测含药血浆对人胃癌BGC-823细胞增殖 取活力大于95%的对数生长期细胞，以1×105接种于96孔培养板内，每组6孔，每组3个复孔，每孔200 μL，用无血浆RPMI-1640培养24 h使细胞生长为G0期。用各组含药血浆培养细胞24、48、72 h后更换培养液，每孔加入MTT(5.0 mg/mL)溶液50 μL，继续培养4 h后离心、吸弃培养液，每孔加入150 μL DMSO，置37 ℃、5% CO2细胞培养箱继续孵育，待结晶物充分溶解后，采用酶标仪测定490 nm 处(630 nm 为参照波长)的吸光度(OD)值，分别计算每组平均抑制率(IR)。抑制率=(空白血清对照组OD 值-实验组OD值)/空白血清对照组OD 值×100%，并绘制细胞抑制率曲线。

1.2.2 流式细胞术检测人胃癌BGC-823细胞周期 将细胞用RPMI-1640培养液调成浓度1×106/mL的细胞悬液，接种于6孔培养板中培养，分为空白血浆组、5-Fu对照组、胃复方低、中、高剂量组，每组3个复孔，吸弃孔内培养基，空白组和5-Fu组分别加入空白血浆和5-Fu含药血浆，其余3组分别加入胃复方低、中、高剂量含药血浆，分别刺激72 h 后，胰酶消化收集细胞。用400 μlPBS使细胞分离，调整加入预冷的乙醇浓度为75%，低温过夜固定。取出固定样品离心弃上清，重复1～2次去乙醇，加入150 μl PI(典化丙啶)工作液，4 ℃避光染色30 min。染色完成后24 h内用流式细胞仪在固定波长处检测荧光强度及散射情况。

1.2.3 荧光定量法检测PTTG、c-Myc、hTERT的mRNA表达 表1显示，细胞以1×106/ml密度接种于6孔细胞培养板中培养，空白组加入无含药血浆，5-Fu对照组及胃复方组低、中、高剂量组加入相应浓度的含药血浆；在加入药物的72 h后，Trizol法提取细胞总RNA，在260 nm和280 nm处测定OD值，计算浓度及纯度；M-MLV法将总RNA逆转录为cDNA；采用SYBR法在qPCR仪上检测PTTG、C-Myc及hTERT基因表达水平；以GAPDH为内参基因，通过2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量。

1.2.4 Western blot检测PTTG、c-Myc、hTERT蛋白的表达 细胞培养及分组同上1.2.3；收集药物处理72 h后的细胞，提取细胞总蛋白，按照BCA蛋白定量测定蛋白浓度，按照比例加入蛋白缓冲液煮沸5 min分装，-80 ℃保存备用。将配置好的4%的浓缩胶加入10%的分离胶，然后将梳子插入，室温下待胶凝固；然后取相同含量的各蛋白样品，分别与裂解液混匀，煮沸5 min置于冰盒中速冷；加样：第一孔点入彩色染料maker，余每孔加已变性的蛋白开始电泳。电泳后开始转膜、封闭，一抗室温孵育、二抗室温孵育，将ECL化学发光液(Thermo)与膜孵育3 min，混合反应后约1 min，在凝胶成像系统上曝光。分别检测PTTG、c-Myc、hTERT蛋白表达水平，β-actin为内参。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 胃复方含药血浆抑制人胃癌BGC-823细胞增殖活性

表2图1显示，与空白对照组比较，5-Fu对照组和胃复方低、中、高剂量各组在分别刺激胃癌BGC-823 细胞24 h、48 h、72 h后的OD 值均降低，中药组按浓度从低至高的顺序，其OD值依次降低并与刺激时长呈负相关。其中72 h时段，各组OD值比较差异有统计学意义(P<0.05)，因此后续实验取72 h，抑制率(IR)依次升高并与刺激时长呈正相关。其中72 h内不同浓度含药血浆随着时间延长抑制率逐渐增强，但到72 h及之后强度呈下降趋势。

表2 胃复方含药血浆对人胃癌BGC-823 细胞增殖的抑制作用

注：含药血浆培养人胃癌BGC-823细胞同一时段OD值比较：与空白血浆组比较:*P<0.05；与胃复方低剂量组比较:&P<0.05；与胃复方中剂量组比较:☆P<0.05；与5-Fu组比较:#P<0.05

图2 胃复方含药血浆对人胃癌BGC-823细胞周期影响比较

图1 胃复方含药血浆对人胃癌BGC-823 细胞增殖的抑制作用

2.2 胃复方含药血浆对人胃癌BGC-823细胞周期的影响

表3图2显示，与空白对照组比较，5-Fu对照组和胃复方低、中、高剂量组分别作用于人胃癌BGC-823细胞72 h后，其G0/G1期细胞比率增加(P<0.05)，S期和G2/M 期均减少(P<0.05)，其中G0/G1期细胞比率随着胃复方浓度提高而增加，与胃复方浓度呈正相关，S期和G2/M 期随着胃复方浓度的提高而减少，与胃复方浓度呈负相关。

表3 胃复方含药血浆对人胃癌BGC-823细胞周期影响比较

注：与空白组比较:*P<0.05；与5-FU组比较比较:#P<0.05；与复方低剂量组比较:&P<0.05；与复方中剂量组比较:☆P<0.05

2.3 人胃癌BGC-823细胞中PTTG、c-Myc、hTERT的mRNA及蛋白表达结果

表4图3显示，与空白对照组比较，药物组均能下调PTTG、c-Myc、hTERT的mRNA及蛋白表达水平(P<0.05，P<0.01)，随着中药剂量的升高而下调效果更明显，呈剂量依赖性。与胃复方低、中剂量组比较，胃复方高剂量组、5-Fu组明显下调PTTG、c-Myc、hTERT的mRNA及蛋白表达量(P<0.05)。Western biot法对各组细胞进行检测蛋白表达条带。

表4 药物组对人胃癌BGC-823细胞PTTG、C-myc、hTERT的mRNA及蛋白表达影响比较

注：与空白对照组比较:*P<0.05，**P<0.01；与胃复方低剂量组比较:△P<0.05；与胃复方中剂量组比较:▉P<0.05

图3 药物组对人胃癌BGC-823细胞中PTTG、C-myc、hTERT蛋白表达的影响

3 讨论

垂体瘤转化基因(pitui tary tumor-transfo rming gene，PTTG)是一种肿瘤转化基因，其突变可以影响肿瘤细胞增殖及凋亡进程[3-4]。原癌基因(c-Myc)是一种与细胞周期密切的核癌基因，它是PTTG下游靶基因，影响细胞生长、增殖、分化，与人类许多肿瘤发生转归相关[5-6]。近年来，相继在多种肿瘤中检测到c-Myc高表达, 同时常伴随其调控上游蛋白PTTG异常表达。有学者提出：“c-Myc-hTERT-细胞无限增殖化”学说，因此基于“PTTG-c-Myc-hTERT-细胞增殖”途径，探索中医药治疗胃癌的可能作用机制，为中医药研究提供新思路。

胃复方是湖南省肿瘤医院中医科临床经验方，主要功效为健脾益气、化瘀解毒，经过30余年的临床实践，对胃癌患者具有较好的临床疗效[7-8]。课题组前期研究证实，胃复方含药血浆能抑制胃癌SGC-7901细胞增殖，诱导凋亡，同时也能够抑制裸鼠移植瘤的生长[9-10]。本实验采用MTT法进一步证实，胃复方不同浓度含药血浆有效抑制人胃癌BGC-823细胞增殖，并呈剂量及时间依赖性。同时运用流式细胞术检测细胞周期，发现其可以阻滞BGC-823细胞由G0/G1 期进入S期，抑制细胞生长。这与国内针对其中某些单药提取物的研究结果相仿。如[11-13]黄芪提取物黄芪多糖、蚤休提取物总皂苷、白术水提取物能够抑制胃癌细胞SGC-7901的增殖，诱导其凋亡。吉爱军等[14]发现，三棱、莪术的水提取物能够阻止细胞无限制从G1 期进入S期，产生细胞增殖抑制及促进凋亡的作用。实验发现[15]，温莪术大小剂量、广莪术大中剂量及蓬莪术中剂量含药血清在加药后48 h 都能抑制胃癌BGC823的细胞增殖。

实验结果还提示，胃复方含药血浆作用细胞后可下调PTTG、C-Myc、hTERT的mRNA及蛋白表达水平。现代药理学研究表明，本研究中所用药材含有效成分，如黄酮类化合物、党参多糖、半枝莲多糖、白花蛇舌草多糖、重楼皂苷、莪术提取物榄香烯、莪术醇等均对多种癌细胞有抑制作用[16-21]，这些有效成分可能构成抗肿瘤的物质基础。

综上所述，胃复方含药血浆可能下调PTTG、c-Myc、hTERT mRNA和蛋白表达来抑制人胃癌BGC-823细胞增殖，阻滞细胞周期进程，从而发挥抗肿瘤作用，为临床提供重要的理论依据，其机制值得深入研究。