金银花药渣中总黄酮的微波辅助提取工艺优化

贺 云, 汲广博, 叶礼卉, 刘 健, 屈 玮, 汪 璐

(合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601)

金银花(Honeysuckle)为忍冬科植物的干燥花蕾,是一味传统的中药[1-3],据报道金银花中含有绿原酸、异绿原酸、木樨草素、皂苷类、挥发油类等许多功能活性成分,具有许多生物药理作用，如抗病菌、抗氧化、抗炎性、清除自由基和清热解毒等功效[4-6]。

中草药在生产成中成药的进程中以及对中药饮片加工过程都会产生大量的药渣[7]。早期常见的处理方式有焚烧、堆放等,这不仅对环境造成了污染,而且造成了浪费,植物类药材经过提取后剩下的药渣依然含有丰富的活性成分,经过一些相应的热解技术可以变废为宝,提升其经济价值。如今提倡绿色可持续发展的理念,工农业生产过程中产生的中药药渣都将广泛应用于培养食用菌,用于畜禽动物饲料和饲料添加剂,用于发酵生产以及作为生物质能源等领域[8]。

目前有文献报道经常用于黄酮提取的方法有传统的热回流提取(heat reflux extraction, HRE)和超声波提取(ultrasound extraction, UE),而这会耗费更多的时间且回收率不好[9-10]。微波辅助提取(microwave assisted extraction,MAE)是指使用适合的溶剂在微波反应器中从天然药用植物、矿物、动物组织中提取各种化学成分的技术和方法,其能够快速升温和破坏植物的细胞膜[11]。

本文采用响应曲面优化法(response surface methodology,RSM)对金银花药渣总黄酮提取工艺条件进行优化,期望进一步地开发利用金银花药渣的经济价值。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

金银花(安徽省邦泰医药有限公司),甲醇(优级纯)、芦丁、木樨草素、槲皮素、绿原酸(美国Sigma公司)、无水乙醇、95%乙醇、Al(NO3)3、NaNO2、NaOH均为分析纯,购于国药集团化学试剂有限公司。微波装置(上海新沂微波化学科技有限公司),酶标仪(美国Bio-Red公司),超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司),高速粉碎机(上海顶帅电器有限公司),冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司),旋转蒸发仪(北京博医康实验仪器有限公司),台式吸引器(绍兴卫星医疗设备公司),纯水仪(英国ELGA公司),液相色谱仪(安捷伦公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 金银花药渣中总黄酮的测定方法

本实验采用亚硝酸钠-硝酸铝法检测总黄酮的量,以芦丁作为标准品。

1.2.2 金银花药渣总黄酮提取工艺流程

称取烘干粉碎的金银花10.0 g,甩滤纸包好后置于索氏提取器中,水浴加热,以70%乙醇作为提取液,80 ℃下提取6 h,将提取后的药渣置于40 ℃烘箱烘干备用。准确称取烘干后的金银花药渣5.00 g,进行乙醇-微波提取,将提取后的滤液旋转蒸发后进行冷冻干燥。

1.2.3 标准曲线的制作

准确称取芦丁10 mg用75%乙醇溶解并定容至10 mL。分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于10 mL比色管中,分别于各管中加入5% NaNO20.4 mL,静置6 min,再加入10% Al(NO3)30.4 mL静置6 min,最后加入5% NaOH 4 mL,用乙醇定容静置15 min。以空白液做参比,然后吸取200 μL于酶标仪中,在510 nm检测OD值[12]。以芦丁质量浓度为横坐标,OD值为纵坐标,绘制芦丁标准曲线。标准曲线方程为:

Y=0.002 5X+0.025 8,R2=0.999 4。

1.2.4 金银花药渣总黄酮提取率测定

准确称取冷冻干燥后的黄酮提取物0.1 g用75%乙醇定容于5 mL,于510 nm检测OD值得出黄酮质量浓度，然后根据公式X=ρVF/m计算总黄酮提取率。其中,ρ为总黄酮质量浓度;V为待测液体积;F为稀释倍数;m为原料质量。

1.3 金银花药渣总黄酮提取条件单因素试验

以总黄酮的提取率为考察指标,分别选取料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)、乙醇体积分数(40%、50%、60%、70%、80%)、提取温度(30、40、50、60、70 ℃)、微波功率(100、200、300、400、500 W)作为单因素进行试验,考察其对金银花药渣总黄酮提取率的影响。

1.4 响应曲面优化试验

根据单因素实验的结果,确定优化因素及其范围如下：乙醇体积分数(A)为50%～70%;微波功率(B)为200～400 W;提取温度(C)为40～60 ℃;提取时间(D)为15～25 min。根据以上数据,采用Box-Behnken设计软件设计优化实验,实验设计见表1所列。

表1 响应曲面实验设计表

1.5 HPLC检测

本文采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)检测药渣中各成份的质量分数。液相条件:SB-C18柱子,流动相为甲醇和水(体积比为65∶35),检测波长为350 nm,流速为1 mL/min,柱温为25 ℃,上样量为20 μL。标准曲线的绘制:分别配制1.0 mg/mL 的绿原酸、木樨草素、槲皮素和芦丁的储备液,然后稀释配置梯度质量浓度的工作液5、10、20、40、80 μg/mL。绘制相应的质量浓度与面积的标准曲线如下:

Y绿=35.18X-26.782,R2=0.999；

Y木=92.037X-107.93,R2=0.999 3；

Y槲=46.684X+89.139,R2=0.998 0；

Y芦=25.78X+21.712,R2=0.999。

通过标准曲线计算出相应产物的质量分数。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 提取时间对药渣总黄酮提取率的影响

准确称取5.00 g 的金银花药渣粉,用体积分数为 50% 的乙醇溶液溶解,按料液比1∶20,微波功率 400 W,温度 50 ℃提取。测定药渣总黄酮的提取率,结果如图1所示。

图1 提取时间对总黄酮提取率的影响

由图1可知,总黄酮提取率随着提取时间的延长先增大后减小,在20 min时其提取率最大。这是由于提取时间太短,黄酮不能充分被浸提出来,而微波加热时间太长会破坏黄酮的结构,使黄酮分解为其他副产物，从而导致其提取率降低。

2.1.2 乙醇体积分数对药渣总黄酮提取率的影响

按1∶20的料液比称取 5.00 g 的金银花药渣粉末,分别加入40%、50%、60%、70%、80% 的乙醇溶液,微波功率 400 W,在50 ℃下进行提取 20 min。测定药渣中总黄酮的提取率,结果如图2所示。

图2 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响

由图2可知，随着乙醇体积分数的增大，药渣黄酮的提取率随之呈现先增大后减小的趋势,当乙醇体积分数达到60%时,其提取率达到最大值。造成这种现象的原因是由于在植物体内黄酮类化合物常与蛋白质等大分子以氢键和疏水键形式结合,而有机溶剂能够破坏这些键的结合,溶剂对物料的渗透性和对细胞膜的破坏性增大了[13],因此随着乙醇体积分数的增大黄酮提取率也提高,但是当乙醇体积分数太大时,会导致乙醇不能够向金银花细胞内渗入,从而影响提取率。

2.1.3 提取温度对药渣总黄酮提取率的影响

按料液比为 1∶20,称取 5.00 g 的药渣粉末于三口烧瓶中,然后加入50%的乙醇溶液,分别用30、40、50、60、70 ℃的温度在400 W微波功率下进行提取 20 min。测定药渣中总黄酮的提取率,结果如图3所示。

图3 提取温度对总黄酮提取率的影响

由图3可知，随着微波提取温度的升高，总黄酮提取率先增大后减小,温度为50 ℃时总黄酮的提取率最大。造成这种情况的原因是温度的高低会影响黄酮向溶剂的传质过程,随着温度的升高,传质速率增大,有利于黄酮的浸出。但温度过高会促进部分受热不均匀的黄酮分解[14],因此提取温度为50 ℃左右为宜。

2.1.4 微波功率对药渣总黄酮提取率的影响

按料液比为1∶20,准确称取 5.00 g 的药渣粉末于三口烧瓶中,然后加入50%的乙醇溶液,分别用功率为100、200、300、400、500 W的微波装置,在50 ℃下提取 20 min。测定药渣中总黄酮的提取率,结果如图4所示。

从图4可以看出，药渣总黄酮的提取率随着微波功率的增大先增大后减小,提取功率达到300 W时黄酮的提取率最大。这是由于微波提取功率主要是影响了升温的速率[15],功率越大,升温速率越大,越能促进黄酮类化合物的浸出；但功率过大反而会导致药渣中活性成分的降低,致使提取率下降。

图4 提取功率对总黄酮提取率的影响

2.2 响应面优化试验结果分析

2.2.1 响应曲面优化实验模型

根据Box-Behnken方法设计的结果,使用Design-Expert 11.0软件设计优化试验,试验结果见表2所列。

表2 响应曲面优化结果

根据表2进行二次回归响应曲面分析,并建立如下模型:

Y=14.320 0+0.240 0A+0.575 8B+
0.401 7C-0.070 8D+0.842 5AB+
0.355 0AC-0.152 5AD-0.442 5BC+
0.092 5BD+1.750 0CD-1.950 0A2-
2.190 0B2-1.700 0C2-0.694 5D2。

其金银花药渣总黄酮提取方差分析见表3所列,而相对应的药渣总黄酮提取回归模型系数显著性检验结果见表4所列。

表3 金银花药渣总黄酮提取方差分析

表4 金银花药渣总黄酮提取回归模型系数显著性检验结果

从表3的结果可以看出,该模型P<0.05,表明其具有显著性；从失拟项可以看出该模型的失拟度不显著,因此可用此模型对金银花药渣总黄酮提取工艺进行优化与预测。

从表4可以看出该模型的一次项不显著,交互项BC和CD最为显著,二次项A2、B2、C2、D2极显著,表明在微波提取条件下各因素对药渣总黄酮提取率的作用是更为复杂的非线性影响。

2.2.2 响应面优化与预测

根据已确定的方程为模型,绘制三维曲面图和对应的等高线图,结果如图5所示。从图5可以看出，乙醇体积分数和微波功率对总黄酮提取率的影响效果相近,响应曲面较为平缓,等高线均匀(图5a)；同样乙醇体积分数和提取温度的效果类似(图5b)；微波功率和提取时间相比,其对药渣总黄酮提取率影响更显著,曲面较陡,提取时间相对较小,曲面比较平缓，两者的交互作用显著,其等高线近乎椭圆形(图5c)；乙醇体积分数和提取时间交互的等高线呈椭圆形,交互作用较强(图5d)；微波功率显著影响其提取率,提取温度作用较小,曲面较缓(图5e)；提取温度和提取时间对药渣总黄酮提取率影响显著，曲面较陡,等高线呈椭圆形(图5f)；通过方差分析显示,微波功率对提取率的影响最大,提取时间次之,然后是乙醇体积分数,提取温度对提取率的影响最小。

通过Design-Expert11.0分析,可以看出金银花药渣总黄酮提取工艺的最优条件如下：乙醇体积分数为61.12%,微波功率为312.59 W,提取温度为54.40 ℃,提取时间为22.93 min。考虑到实际操作选取最优条件为乙醇体积分数60%,微波功率300 W,提取温度54 ℃,提取时间23 min。在此最优条件下药渣总黄酮提取率的预测值为14.41%。

图5 各个单因素之间的交互作用对提取率的影响

2.3 验证试验

为考察响应曲面优化试验的稳定可行性,按料液比为1∶20准确称取5.00 g冻干的金银花药渣粉末于三口烧瓶中,按照上述的微波提取优化的条件(乙醇体积分数60%,微波功率300 W,提取温度54 ℃,提取时间23 min)进行微波提取,重复3次。按2.1.4节检测黄酮提取率,得到最终提取率为14.24%。说明响应面法适用于金银花药渣总黄酮的微波-乙醇提取工艺进行回归分析和参数优化。

2.4 金银花药渣提取物中有效成分分析

在最优化的微波提取条件下,根据HPLC的检测结果可以发现,药渣提取物中还有绿原酸、木樨草素、槲皮素和芦丁等有效成分,其质量分数分别为2.98%、0.95%、0.51%和0.70%。

3 结 论

本文选取了微波辅助法提取金银花药渣中的总黄酮,采用Box-Behnken设计方法经过响应面回归模型和方差分析可知,乙醇体积分数、微波功率、提取时间和提取温度这4种因素的交互作用对黄酮的提取率有显著影响，且建立的模型P<0.05,说明二次方程拟合显著,其中失拟项P>0.05,即失拟项差异不显著,该方程对试验的结果有较好的拟合性。验证性试验的结果也表明微波辅助提取金银花药渣总黄酮的提取率达到14.24%。因此乙醇体积分数60%,微波功率300 W,提取温度54 ℃,提取时间23 min是金银花药渣总黄酮提取工艺的最优条件。而且在该条件下所提取的绿原酸、木樨草素、槲皮素和芦丁的质量分数分别为2.98%、0.95%、0.51%和0.70%。本文研究也为金银花药渣的再利用提供了依据。