蒽酮比色法快速测定大麦叶片中可溶性糖含量的优化

张述伟，宗营杰，方春燕，黄赛华，李静，许建华，王亦菲，*，刘成洪，*

（1.上海市农业科学院生物技术研究所，上海201106；2.上海市农业遗传育种重点实验室，上海201106；3.光明种业有限公司，上海202171）

大麦（Hordeum vulgare L.）是全球第四大禾谷类作物[1]，种植分布广，适应性强，耐干旱和贫瘠，耐寒和耐盐性也较好[2]，具有重要的经济价值。大麦是酿造啤酒和生产饲料的重要原料，大麦籽粒营养成分丰富，富含纤维、蛋白质、糖等，具有较高的食用价值[3]，大麦秸秆可作为畜牧饲料，提高动物肉质[4]，大麦嫩叶可加工成功能性食品麦绿素（barley grass）等，具有很好的营养与保健价值[5-6]。可溶性糖作为信号分子在植物体内调节植物生长，在植物的生长发育及形态构成过程中起重要作用[7-9]。植物组织中可溶性糖含量测定是一项常规检测指标[10]，因此建立快速准确的检测方法对于科研和生产具有重要意义。蒽酮法是目前常用的糖定量测定方法[11]，其原理是糖在浓硫酸作用下，脱水反应生成糠醛或甲基糖醛与蒽酮反应，生成蓝绿色化合物，在一定范围内，颜色深浅与可溶性糖含量成正比[12]。蒽酮比色法显色稳定，准确性高，操作简便快捷，广泛应用于各种植物组织中的可溶性糖含量测定[13]。但经典蒽酮法测定反应体系用量大，不能适应快速微量测定与筛选的需要。

目前还未见蒽酮比色法微量测定方法的报道，本研究对经典蒽酮比色法反应体系中蒽酮与浓硫酸用量、反应温度、反应时间、测定时间以及叶片取样部位等条件进行优化研究，以期建立适合微孔板批量测定筛选的方法，为品质育种和基础研究提供可溶性糖指标的检测手段。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

大麦：品种“花30”，上海市农业科学院生物技术研究所植物细胞工程研究室提供。2017年11月播种于上海市农业科学院实验田，条播种植，正常水肥管理，至4叶期～5叶期进行取样。

1.1.2 主要仪器

Multiskan FC型多功能酶标仪：赛默飞世尔仪器（上海）有限公司；96孔透明板：康宁公司；GL2241-1SCN电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；HWS26型水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司。

1.1.3 试剂

葡萄糖（分析纯）：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；蒽酮（分析纯）、乙酸乙酯（分析纯）：生工生物工程（上海）股份有限公司；浓硫酸（分析纯，1.84 g/cm3）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 显色反应温度优化

准确吸取 400 μL 葡萄糖标准溶液（0.5 μg/μL）于2.0 mL离心管中，加入100 μL超纯水，混匀后，依次加入 100 μL 蒽酮乙酸乙酯溶液（20 mg/mL）和 1 000 μL浓硫酸，盖紧并充分混匀后，分别置于16℃（金属浴）、25℃（水浴）、80℃（水浴）、100℃（水浴）下进行显色反应，每个温度设置3个重复，加热计时10 min，取出试管架置于湿冰水浴中迅速冷却至16℃，10 min后取出，置于96孔透明板中，使用酶标仪在620 nm波长下测定其吸光度。

1.2.2 显色反应时间优化

分别在 5、10、15、20、25 min 后进行显色反应，每个时间点设置复管，同上在620 nm波长下测定其吸光度。

1.2.3 显色反应体系优化

采用正交试验设计对显色反应所使用的蒽酮和浓硫酸用量进行了优化，其中蒽酮（20 mg/mL）体积采用 4 个水平（10、50、100、150 μL），浓硫酸体积采用3个水平（100、500、1 000 μL），在最优显色反应温度和最优时间条件下进行反应，测定其吸光度。

1.2.4 标准曲线绘制

称取干燥后葡萄糖标准品溶于超纯水，配制500 μg/mL标准品母液，吸取相应体积母液配制10 μg～200 μg的总体积为500 μL的不同浓度的葡萄糖标准溶液，加入蒽酮溶液（溶于乙酸乙酯，母液浓度20 mg/mL）100 μL 和浓硫酸（密度 1.84 g/cm3）1 000 μL，放入沸水浴，取出离心管，放在湿冰上冷却10 min。取100 μL显色液置于96孔透明板中，采用Thermo FC多功能酶标仪，在620 nm波长下测定其吸光度，读取数据，以吸光度A为纵坐标，以糖含量C为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程和相关系数R；由标准线性方程可求出测定糖量，计算原样品中的可溶性糖含量。

1.2.5 稳定性试验

取大麦品种“花30”鲜叶（剪碎混匀）可溶性糖提取液10份，同时进行显色反应，测定其吸光度，并根据标准曲线计算样品可溶性糖含量，在16℃下放置不同时间（0、20、30、40、60 min 和 120 min）测定样品的可溶性糖含量。

1.2.6 样品提取时间优化

取大田生长的大麦幼嫩叶片（4叶期～5叶期），剪碎后称取约100 mg，放入2.0 mL离心管中；同时称取大麦茎叶干粉约100 mg，放入2.0 mL离心管中。加入少许液氮，用小研磨棒迅速研磨成碎片，加入1 000 μL超纯水，采用沸水浴（100℃）提取不同时间（10、20、30、40、50、60 min），每个时间点设置 3 个重复，相同处理测定吸光度。

1.2.7 取样部位选择优化

取大麦品种“花30”大田生长幼苗（4叶期～5叶期）的顶叶（完全展开叶）、倒二叶、倒三叶和茎段中可溶性糖含量，另外将倒二叶和倒三叶按叶长顺序平均分为3段，分别装入2.0 mL离心管中，向其中加入少许液氮，用研磨棒迅速研磨成粉；待液氮挥发完全，加入1.0 mL超纯水，混匀放入沸水浴（100℃）加热，10 min后取出离心管冷却至16℃，10 000 r/min离心3 min；小心吸取上清溶液50 μL到另一干净的2.0 mL离心管中，依次加入450 μL超纯水，100 μL蒽酮（20 mg/mL）和 1 000 μL 浓硫酸，混匀；沸水浴加热7 min；同上在620 nm波长下测定其吸光度。

1.3 数据处理

采用DPS 7.05软件进行数据分析，采用Microsoft Excel软件作图，显著水平 P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 温度对显色反应产物吸光度的影响

通过葡萄糖与蒽酮硫酸溶液在4个不同温度下进行显色反应，比较不同反应产物的吸光度值（A）大小，结果见图1。

图1 不同温度对显色反应产物吸光度值的影响Fig.1 Effects of different temperatures on the absorbance of the reaction products

结果表明采用100℃沸水浴温度时反应完全，测定吸光度值最高，因此显色反应温度采用100℃沸水浴。

2.2 水浴时间对显色反应产物吸光度的影响

通过葡萄糖与蒽酮硫酸溶液在100℃沸水浴进行显色反应，得到水浴时间对显色反应产物吸光度的影响见图2。

结果表明，随着时间的延长吸光值逐步下降（图2A），反应时间5 min时显色反应测定吸光度值最高，但与10 min相比差异不显著；因此进一步比较了5个更短时间（1、3、5、7 min和9 min）反应吸光度值（图2B），随着时间的变化，吸光度呈现先上升后下降趋势，5 min和7 min之间差异不显著但是7 min显色反应测定吸光度值最高，因此显色反应时间确定为7 min。

图2 沸水浴反应时间对吸光度的影响Fig.2 Absorption values at different reaction temperatures

2.3 蒽酮-硫酸反应体系的优化

为了缩小反应体系体积，减少蒽酮与浓硫酸用量，采用正交设计对蒽酮-浓硫酸反应体系进行了优化，结果见表1和图3。

表1 不同蒽酮-浓硫酸反应体系对吸光度的影响Table 1 Effects on absorbance of different anthrone-sulfuric acid reaction system

由表1可看出，当浓硫酸从100μL增加到1000μL，蒽酮溶液从10 μL增加到50 μL以上时，显色反应产物吸光度值大幅度提高，数值均在1.0以上。在浓硫酸1 000 μL和蒽酮150 μL时吸光度值达到最大，但是与在浓硫酸1 000 μL和蒽酮100 μL吸光度值相比差异不显著。由图3可看出当浓硫酸用量大于1 000 μL时，吸光度值逐渐降低。因此，最优的蒽酮和浓硫酸显色反应体系确定为 100 μL 蒽酮（20 mg/mL）和 1 000 μL浓硫酸。

图3 反应体系中不同浓硫酸体积对吸光度的影响Fig.3 Effects on absorbance of different concentrated sulfuric acid volumes in reaction system

2.4 标准曲线的绘制

采用上述优化的反应条件，测定并绘制了葡萄糖标准品浓度与吸光度的标准曲线，见图4。

图4 葡萄糖标准曲线Fig.4 Standard curve of glucose

由图4可以看出，利用微孔板测定法在葡萄糖标准品浓度 10 μg/mL～200 μg/mL 的相关系数为 R2=0.998 3，范围内线性关系良好，回归方程为y=0.007 5x+0.022 3，式中：y为吸光度；x为葡萄糖含量。

2.5 稳定性试验

对于显色反应产物吸光度测定的稳定性，采用同一测定样品溶液放置2 h内进行多个时间点（0、20、30、40、60 min 和 120 min）测定，结果见表 2。

由表2可看出10个样品不同时间点测定值的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）均小于3%，说明测定样品溶液2 h内测定结果比较稳定。

2.6 大麦叶片样品提取时间的优化

为了对大麦叶片中可溶性糖进行快速提取，采用叶片鲜样或干样按1∶10（g/mL）的料液比进行水加热提取，对不同浸提时间（10、20、30、40 min 和 50 min）的可溶性糖含量进行了测定比较。结果见图5。

表2 同一测定样品溶液放置不同时间后的测定稳定性结果Table 2 Determination of stability after the same sample solution was placed at different times

图5 大麦嫩苗同一叶片样品不同提取时间的可溶性糖含量比较Fig.5 Comparison of soluble sugar content in the same leaf samples of barley grass at different extraction time

结果表明，在该料液比体系中沸水浴10 min提取可溶性糖，与其它更长水浴时间相比，提取含量均不存在显著性差异，因此本体系的水浴时间采用10 min。

2.7 大麦叶片取样部位的优化

为了减少叶片取样部位的可溶性糖含量差异，对不同叶片位置和同一叶片不同部位的可溶性糖进行了测定比较。结果见图6。

由图6可看出，大麦不同位置的叶片可溶性糖含量依次为：倒三叶＞倒二叶＞顶叶；倒三叶、倒二叶的同一叶片不同部位可溶性糖含量依次为：顶部＞中部＞基部。为了方便取样，可统一选取倒二叶的顶部叶片进行可溶性糖含量测定。

图6 大麦嫩苗不同组织部位和叶片部位可溶性糖含量比较Fig.6 Comparison of soluble sugar content in different tissue parts and leaf parts of barley grass

3 结论与讨论

糖是高等植物的主要代谢产物之一，参与了植物生长、发育与抗性反应的多个生理过程[14-15]。同时，可溶性糖还是植物果实风味的重要物质[16-17]。因此，植物可溶性糖含量是植物生理与品质研究中的一个重要测定指标。常用的测定方法有比色法[18]、近红外光谱法[19]、高效液相色谱法[20]等。蒽酮硫酸比色法是可溶性糖测定中简单快捷的方法之一，本研究在此基础上对提取方法和测定体系做了进一步优化，以满足对植物叶片新鲜样品的可溶性糖含量进行微量化快速筛选的需求。与现有测定方法相比，本试验建立方法的优点在于：建立了合适的反应体系，大大减少了蒽酮和硫酸的用量，节约试剂，方便操作大批量测定；样品直接微量取样，对植株影响较小，取样方便，重复误差小，且可多次取样对植株含糖量变化进行追踪；样品处理操作简单，使用液氮处理磨样不需要使用干样，简单提取后采用酶标板快速测定方法，减少试验步骤，节省时间；使用的酶标板测定，仪器操作简单，测量过程快速，可实现大规模测量，适合于针对大批量材料采用高通量的筛选，可行性高。该方法不仅适用于大麦，同样可用于小麦、青稞、水稻等，为植物活体叶片中可溶性糖含量的时空分布规律研究提供了简便有效的评估手段，为植物的耐逆性研究和品质改良提供有效的参考价值。

本试验通过优化蒽酮-浓硫酸反应体系、反应温度、反应时间以及大麦叶片部位和提取方法，建立了针对大麦嫩苗中可溶性糖含量微量化快速测定方法：采用蒽酮-浓硫酸（用量分别为100 μL和1 000 μL），反应温度为100℃，反应时间为7 min，显色反应充分；测定大麦嫩叶取倒二叶片顶部，液氮磨碎后用水（100 mg鲜样∶1 000 μL超纯水）加热提取10 min即可完成叶片可溶性糖提取。