细叶百合LpPEX7基因克隆及盐胁迫下的表达特性分析

何 好 朱国庆 陈诗雅 徐 畅 金淑梅

(东北盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室，生命科学学院，东北林业大学，哈尔滨 150040)

过氧化物酶体含有丰富的各种酶类，如氧化酶、过氧化物酶等，参与活性氧的生成与降解，毒性物质的清除，对保护细胞起了重要作用[1～2]。过氧化物酶体生物合成酶(PEX)是一系列参与过氧化物酶体合成的蛋白，是过氧化物酶体在生物体内合成的关键酶，目前已经发现了三十多种PEX蛋白[3]，PEX蛋白在植物体提高抗逆能力中起重要作用[4～6]。

构成过氧化物酶体的蛋白质有两类:膜蛋白(peroxisomal membrane protein，PMP)和基质蛋白[7]。膜蛋白和基质蛋白正确组装，形成了成熟的过氧化物酶体。基质蛋白的转运是由其本身肽链上的定位信号(peroxisomal targeting signal，PTS)来完成的[8]。PTS有PTS1和PTS2两种[9]。PTS1是C-末端过氧化物酶体靶向信号类型1，PTS2是N-末端过氧化物酶体靶向信号类型2[10～11]。PEX7是PTS2的受体，由PEX7基因编码，是形成过氧化物酶体的关键蛋白[12～14]。在PEX7突变体中不仅观察到PTS2蛋白质运输进入过氧化物酶体的缺陷，而且还观察到了PTS1运输进入过氧化物酶体的缺陷[15～16]。

胡杨PePEX11能够提高拟南芥在盐胁迫下的抗氧化能力，提升耐盐能力[5]。超表达拟南芥PEX11基因可促进过氧化物酶体增殖，而RNAi植株则会减少氧化物酶体数量[17]。缺失PEX11基因会降低过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的表达，从而降低对逆境胁迫的抵抗能力[18]。过表达腊梅CpPEX22基因的烟草在受到H2O2胁迫后，CAT、SOD、POD活性和MDA含量都比未转基因的烟草中有所提高[6]。虽然已知过氧化物酶体是保护细胞、增强植物对盐碱耐受性的重要细胞器，PEX7蛋白是合成过氧化物酶体的关键蛋白，但PEX7蛋白是否在盐碱或氧化逆境中发生一定的功能未见研究报道，PEX7基因是否也如同PEX11以及PEX22基因一样，与盐碱或氧化逆境有一定的应答关系，是本研究要解决的主要问题。

我们对20 mmol·L-1NaHCO3处理后的细叶百合转录组分析发现，LpPEX7基因的表达量明显上调，本研究克隆出LpPEX7基因的开放阅读框，对LpPEX7的生物信息学进行了分析，在H2O2，NaCl或NaHCO3逆境胁迫条件下，对LpPEX7基因表达量进行了研究，LpPEX7基因转入模式植物拟南芥中，提高了拟南芥的抗盐碱和抗氧化的能力，为详细研究该基因的抗盐碱功能奠定理论和材料基础。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

植物材料为组织培养的细叶百合，ES-Taq DNA Polymerase、RT-PCR试剂盒、PMD-18T载体、限制性内切酶购自Takara公司，UltraSYBR Mixture试剂，胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司，试验所需菌株大肠杆菌DH5α和EH105来自本实验室。

1.2 LpPEX7基因开放阅读框的克隆

通过分析细叶百合转录组数据库序列，设计了一对特异性引物(上游为LpPEX7F：5′-CGCACCATGCCAGTCTT-3′,下游为LpPEX7R：5′-CAAGTATCAGGCCACTGC-3′)，采用CTAB法[19]提取细叶百合的总RNA，使用Reverse transcription-PCR试剂盒对提取的总RNA进行反转录，获得细叶百合cDNA，以cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环；72℃补充延伸10 min。电泳检测得到的PCR产物，利用胶回收试剂盒进行回收，将回收片段连接到PMD-18T载体并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃过夜培养，挑取单克隆摇菌，PCR鉴定后，菌液送公司测序。

1.3 生物信息学分析

利用在线工具ProtParam分析蛋白质的理化性质、SignalP-5.0 Server分析预测存在信号肽的概率、TMHMM Server v.2.0分析预测LpPEX7有无跨膜蛋白结构、PSIPRED V4.0预测LpPEX7蛋白的二级结构、SWISS-MODEL分析LpPEX7蛋白三级结构、SMART:Main page分析LpPEX7的保守结构域、MEME分析motif。将克隆基因测序得到的结果在NCBI中进行blast分析，找出相似度较高的其他物种PEX7的氨基酸序列，利用DNA Man软件进行蛋白质同源氨基酸序列比对，使用MEGA3.1构建进化树，观察细叶百合PEX7与其他物种PEX7的亲缘关系的远近。

1.4 LpPEX7基因在细叶百合不同器官中的表达特性

分别提取细叶百合根、鳞茎、叶、花、种子的RNA，并反转录成cDNA。根据LpPEX7基因序列设计一对引物(上游为qPCRLpPEX7F:5′-TCCGAGTCTCACGAGTCCAT-3′，下游为qPCRLpPEX7R:5′-CAGTAGGCATGCTCCCGAAA-3′)。利用UltraSYBR Mixture试剂进行实时荧光定量qRT-PCR检测，反应体系为20 μL(2×SYBR Green Mix 10 μL；10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL；cDNA模板1 μL；ddH2O 8 μL)；反应条件为：95℃预变性10 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，40个循环。得到细叶百合不同器官中LpPEX7基因的表达量并进行分析。

1.5 LpPEX7基因在逆境处理后的细叶百合叶和鳞茎中的表达特性

将组织培养瓶中生长一致的细叶百合植株移入到MS培养基(CK)和分别添加200 mmol·L-1NaCl，20 mmol·L-1NaHCO3，11 mmol·L-1H2O2的MS培养基中，不同胁迫处理6、12、24，36、48 h后，提取叶和鳞茎的RNA。将RNA反转录为cDNA，利用1.4设计的引物进行qRT-PCR，分析LpPEX7基因在胁迫处理后的细叶百合叶和鳞茎中的表达情况。

1.6 LpPEX7基因过表达拟南芥种子萌发抗盐碱表型分析

根据1.2测序得到的序列结果，设计添加带限制性内切酶的引物(上游为：pPEX7BamHⅠF5′-GGATCCATGCCAGTCTTCAAAAC-3′,下游为：pPEX7SalⅠR5′-GTCGACTCAGGCCACTGCTCTG-3′引物中带下划线部分分别为限制性内切酶BamHⅠ、SalⅠ的序列)，LpPEX7连接到pMD18-T载体上的质粒为模板进行PCR扩增，PCR产物电泳并回收目的条带，连接到pMD18-T载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α。转化后的菌液提取的质粒和pBI121质粒分别用BamHⅠ和SalⅠ双酶切，回收酶切后的基因和载体片段，利用T4连接酶22℃过夜连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，KaNa青霉素筛选阳性克隆，酶切鉴定正确后，用电击法将pBI121-LpPEX7质粒转入农杆菌EHA105菌株。利用农杆菌介导的花浸法[20]将携带pBI121-LpPEX7外源基因的农杆菌EHA105转入模式植物拟南芥中。收获的T1代转基因拟南芥种子消毒后铺在含有KaNa的1/2MS筛选培养基上萌发，筛选出的能正常生长的绿色植株连续自交2代得到T3代纯合种子，利用试剂盒提取生长两周的T3代种子萌发后的幼苗叶片RNA，利用qRT-PCR检测8株过表达LpPEX7的拟南芥株系中的LpPEX7基因表达量，qRT-PCR方法同1.4。

含有1/2MS和分别添加H2O2(2，3 mmol·L-1)、NaCl(125，150 mmol·L-1)和NaHCO3(3，5 mmol·L-1)的1/2MS培养基的圆形玻璃平板均分4个扇形结构，野生型拟南芥和T3代过表达LpPEX7基因的拟南芥株系#1、#2、#3的种子播种在4个扇形区域，每个区域14粒种子。播种后的平板于4℃春化48 h，转移到人工气候培养箱培养中，10 d后观察在不同胁迫处理下野生型和过表达LpPEX7基因的拟南芥株系的种子萌发状况并拍照，实验均设置3次重复。

2 结果与分析

2.1 LpPEX7基因开放阅读框的克隆

以细叶百合cDNA为模板，以LpPEX7F，LpPEX7R为引物，进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳显示，大小约为1 000 bp的位置有PCR产物条带(图1)。将条带回收后与pMD-18T载体连接并转化到大肠杆菌DH5α中，挑取单克隆菌落摇菌后进行PCR检测，将检测条带位置正确的菌液提取质粒送公司测序，测序结果为957 bp。

图1 LpPEX7-T PCR检测Fig.1 LpPEX7-T PCR assay M.DL5000 marker；1.LpPEX7-T

2.2 生物信息学分析

ProtParam软件在线分析蛋白质的理化性质：分子式为C1594H2402N436O464S11、相对分子质量为35 449.91 Da、等电点为5.46、不稳定系数为40.24、总平均亲水性为-0.108。通过在线分析工具SignalP-5.0 Server：分析预测存在信号肽的概率为0.001 1，TMHMM Server v.2.0分析预测无跨膜蛋白结构。在线分析工具PSIPRED V4.0预测LpPEX7蛋白的二级结构，存在许多股和卷曲结构(图2A)，SWISS-MODEL在线软件分析其三级结构，与二级结构预测结果相符合(图2B)。SMART软件分析LpPEX7的保守结构域，存在6个WD40结构域、1个PQQ结构域和1个6PGD结构域。6个WD40结构域位置分别在50～89、95～135、138～178、181～221、225～265和269～309氨基酸处(图2C)，而PQQ和6PGD结构域在16～56、40～201氨基酸处。

图2 LpPEX7结构分析 A.LpPEX7二级结构预测；B.LpPEX7三级结构预测；C.LpPEX7保守结构域预测Fig.2 Structural analysis of LpPEX7 A.Prediction for the secondary structure of LpPEX7; B.Prediction for the tertiary structure of LpPEX7; C.Prediction of the conserved domains of LpPEX7

图3 LpPEX7与其他植物同源蛋白的氨基酸序列比对Fig.3 Amino acid sequence alignment of LpPEX7 with other plant homologous proteins

图4 细叶百合LpPEX7与其他植物PEX7蛋白序列MEME聚类分析Fig.4 MEME cluster analysis of LpPEX7 with other plant PEX7 proteins

利用DNA Man软件将细叶百合LpPEX7和其他物种PEX7的氨基酸序列(海枣PhoenixdactyliferaXP_008813497.1，83.96%；铁皮石斛DendrobiumcatenatumXP_020705736.1，82.7%；深圳拟兰ApostasiashenzhenicaPKA46872.1，83.02%；油棕ElaeisguineensisXP_010925636.1，83.33%；姬蝴蝶兰PhalaenopsisequestrisXP_020576756.1，80.82%；菜豆PhaseolusvulgarisXP_009404509.1，76.18%；赤豆VignaangularisXP_017436924.1，76.18%)进行对比(图3)，发现该蛋白的氨基酸序列与其他植物的PEX7具有较高的同源性以及相似的保守区，认为从细叶百合cDNA中克隆出来的基因为PEX7，命名为LpPEX7，NCBI登录号为MN380029。利用MEME在线软件分析细叶百合LpPEX7与其他植物PEX7蛋白序列排名前三的motif(图4)，细叶百合LpPEX7基序a位置在1～50氨基酸处、基序b和c主要分布在WD40保守区域。

利用MEGA3.1构建进化树后发现，LpPEX7蛋白与海枣、铁皮石斛、深圳拟兰、油棕、姬蝴蝶兰等植物的PEX7亲缘关系较近(图5)。

2.3 LpPEX7基因在细叶百合不同器官中的表达特性

运用qRT-PCR检测LpPEX7基因在细叶百合不同器官的表达特异性，3组重复的表达差异较小，数据可靠。本研究中LpPEX7基因在细叶百合的种子中表达量最高、叶片和鳞茎中表达量较高(图6)。

2.4 LpPEX7基因在逆境处理后的细叶百合叶片和鳞茎中的表达特性

为了分析LpPEX7基因与盐碱逆境的关系，选取了200 mmol·L-1NaCl、20 mmol·L-1NaHCO3、11 mmol·L-1H2O2三种逆境，对细叶百合进行不同时间梯度的逆境胁迫处理，结果显示，LpPEX7基因受到这三种逆境的诱导后表达量都有所增加。不同胁迫处理后，随着处理时间的变化，叶中LpPEX7的表达量先增加后降低，200 mmol·L-1NaCl处理12 h后叶中LpPEX7的表达量达到最大(图7A)。20 mmol·L-1NaHCO3处理24 h后表达量达到最大(图7B)。11 mmol·L-1H2O2处理12 h后叶中LpPEX7的表达量达到最大(图7C)。

图5 LpPEX7与其他植物同源蛋白的进化树分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of LpPEX7 and other plant homologous proteins

图6 LpPEX7基因在细叶百合不同部位表达量Fig.6 The expression of LpPEX7 gene in different parts of Lilium pumilum

随着200 mmol·L-1NaCl处理时间的变化，鳞茎中LpPEX7的表达量先增加，在处理12 h后达到最大(图7D)，降低后再有少量增加。20 mmol·L-1NaHCO3胁迫处理后，随处理时间的增加鳞茎中LpPEX7的表达量先增加然后降低，在处理24 h时达到最大表达量(图7E)。11 mmol·L-1H2O2胁迫处理的鳞茎中LpPEX7表达量表达量也是先增加后降低，然后再增加，在H2O2处理12 h后达到最大表达量(图7F)。LpPEX7基因的表达量在逆境处理的24 h内都得到了大量表达，这说明在遇到胁迫的条件下，LpPEX7基因能立即开始表达，参与到应激反应过程中，从而增加植物的抗逆性。

2.5 LpPEX7基因过表达拟南芥种子萌发抗盐碱表型分析

为在植物中高效表达LpPEX7这个外源基因，选取了由35S启动子驱动的植物表达载体pBI121进行了载体构建，将构建的pBI121-LpPEX7质粒进行BamHⅠ/SalⅠ双酶切，基因与载体位置正确(图8A)，说明pBI121-LpPEX7构建成功。如图8B所示，以未转基因的拟南芥为阴性对照，利用qPCR检测的方法，得到#1～#8转基因的拟南芥中LpPEX7基因的表达量均比未转基因的拟南芥中高，最高达到30倍左右，这说明细叶百合中LpPEX7这个基因转化拟南芥成功，并且得到了高表达。选择LpPEX7过表达株系中LpPEX7表达量相对较高的#1、#2和#3株系进行后续实验。

2.6 过表达LpPEX7基因的拟南芥植株抗性分析

LpPEX7基因在细叶百合的种子中表达量最高，为了验证转入LpPEX7基因的拟南芥株系的种子对于盐及氧化逆境是否具有一定的耐受性，我们选取野生型和自交3代的三个转基因株系#1、#2、#3的种子进行了耐盐性的初步实验。各个株系的种子在培养箱中培养10 d左右，观察种子的萌发结果如图9，在没施加任何胁迫的1/2MS培养基中，野生型和三个转基因植株的萌发状态几乎一致，但是在胁迫处理的培养基中，转基因和非转基因拟南芥株系的生长状态有明显的区别，在2 mmol·L-1H2O2、3 mmol·L-1H2O2、125 mmol·L-1NaCl和3 mmol·L-1NaHCO3胁迫处理培养基中，4种株系的种子都能发芽，但野生型植株的种子萌发比过表达植株#1和#3的种子萌发晚1～3 d。在150 mmol·L-1NaCl和5 mmol·L-1NaHCO3的抗性培养基上，野生型几乎不能正常萌发,而转基因株系#1和#3的多数种子可以萌发，种子发芽率比野生型的明显好，#2过表达和野生型植株种子的萌发率差不多。

图7 逆境胁迫下细叶百合叶片和鳞茎中LpPEX7基因的表达量 A～C.LpPEX7基因分别在200 mmol·L-1 NaCl、20 mmol·L-1 NaHCO3、11 mmol·L-1 H2O2处理后细叶百合叶中的表达量；D～F.LpPEX7基因分别在200 mmol·L-1 NaCl、20 mmol·L-1 NaHCO3、11 mmol·L-1 H2O2处理后细叶百合鳞茎中的表达量Fig.7 LpPEX7 gene expression in leaves and bulbs of L.pumilum under stress A-C. The expression of LpPEX7 gene in leaves of L.pumilum after treatment with 200 mmol·L-1 NaCl,20 mmol·L-1 NaHCO3 and 11 mmol·L-1 H2O2,respectively; D-F. The expression of LpPEX7 gene in bulbs of L.pumilum after treatment with 200 mmol·L-1 NaCl,20 mmol·L-1 NaHCO3 and 11 mmol·L-1 H2O2,respectively

图8 pBI121-LpPEX7的酶切鉴定和实时荧光定量PCR鉴定LpPEX7基因的表达量 A.pBI121-LpPEX7的酶切鉴定(M. DM5000 Marker；1.pBI121-LpPEX7的双酶切)；B.实时荧光定量PCR鉴定LpPEX7基因的表达量(WT.野生型拟南芥；#1～#8.LpPEX7过表达株系)Fig.8 pBI121-LpPEX7 identified by restriction enzymes and identify the expression of LpPEX7 gene by qRT-PCR A.pBI121-LpPEX7 identified by restriction enzymes(M. DM5000 Marker; 1. pBI121-LpPEX7 digested by double enzymes); B.Identify the expression of LpPEX7 gene by qRT-PCR(WT. Wild type A.thaliana；#1-#8. LpPEX7 overexpression lines)

图9 萌发期野生型和LpPEX7基因过表达拟南芥的抗逆性分析 WT.野生型拟南芥；#1～#3.LpPEX7过表达株系Fig.9 Resistance analysis of wild type and LpPEX7 overexpression A.thaliana on germination stage WT.Wild type A.thaliana；#1-#3.LpPEX7 overexpression lines

3 讨论

PEX7蛋白作为带有PTS2信号基质蛋白的转运蛋白，对过氧化物酶体的合成起到至关重要的作用。对PEX7突变体的研究发现，PEX7蛋白的缺失，不仅PTS2蛋白的转运异常，PEX5和PEX7相互作用，致使PTS1蛋白的转运也发生异常[15,21]。由此看来，LpPEX7蛋白对于过氧化物酶体的形成起着至关重要的作用，过氧化物酶体是一种亚细胞器，富含各种酶类，参与活性氧的生成与降解，毒性物质的清除，其数量的增多，可以提高植物对活性氧毒害的耐受性，进而提高植物的抗逆性，因此对LpPEX7基因的表达性质进行研究，对研究植物的耐盐碱能力具有重要作用。

通过对NaHCO3处理后的细叶百合转录组数据分析，发现LpPEX7基因的表达量明显上调，我们从细叶百合鳞茎中克隆得到这个基因的ORF区，通过在NCBI数据库中Blast发现这个基因与其他植物的PEX7相似度很高，同源序列比对和进化树分析确定这个基因是PEX7。

在LpPEX7基因编码的氨基酸中存在着与海枣、铁皮石斛、油棕等Pex7蛋白相同的WD-40蛋白重复序列特征，WD-40结构域介导蛋白质之间的相互作用，并能与其他蛋白互作，形成复合体结构，进而调控下游的反应[22]，因此推测，在盐碱胁迫条件下，LpPEX7可能与其他调控盐碱逆境的蛋白相互作用，或者调控下游基因的反应来提高植物的抗逆性。G6PD结构域属于6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶典型结构域，能参与多种非生物胁迫[23]，LpPEX7蛋白具有一个G6PD结构域，这个结构域可能使LpPEX7蛋白在参与多种非生物胁迫中发挥重要的作用。PQQ(Pyrroloquinoline quinone，吡咯喹啉醌)是一种氧化还原酶的辅酶，PQQ对自由基有清除作用，可以保护机体减少氧化损伤[24]。LpPEX7的保守结构域分析发现，LpPEX7含有一个PQQ结构域，由于盐碱逆境能产生大量的氧自由基(活性氧)，本研究进行了未转基因和转基因的拟南芥株系种子在H2O2逆境胁迫下的萌发对比实验，过表达LpPEX7基因的拟南芥在逆境条件下能够提高种子的萌发效果，或许就是通过清除逆境所产生的大量自由氧基的作用来实现的。

海枣的PEX7是从海枣线粒体转录组中发现的[25]，铁皮石斛Pex7与花发育及适应性进化有关[26]，油棕Pex7蛋白在果实后熟过程中表达丰富[27]，菜豆Pex7与种子中的高淀粉和低脂肪有关[28]。蛋白质同源序列比对和进化树分析发现LpPEX7与这些物种的PEX7比较接近，本研究中LpPEX7基因在花和种子中均有表达，并且在细叶百合的种子中表达量最大，这说明LpPEX7基因除了能在提高植物逆境方面起作用外，可能在植物的生长发育过程中也起到重要作用。

用qRT-PCR检测细叶百合不同器官中LpPEX7的表达量发现，在种子、叶片和鳞茎中表达量高，在根和花中的表达量比较低。从LpPEX7基因在胁迫处理后的细叶百合叶片和鳞茎中表达量来看，LpPEX7基因在H2O2，NaCl或NaHCO3胁迫处理12或24 h的表达量最高，说明在植物受到逆境胁迫后，LpPEX7立刻启动表达程序来应对环境的改变。PEX7是过氧化物酶体生物合成的关键酶，提高LpPEX7的表达量，也许过氧化物酶体合成的数量有所增加，进而提高植物的抗逆能力。

LpPEX7在不同细叶百合器官中的表达量研究发现，LpPEX7基因在种子中表达量高，因此我们做了种子萌发期植物抗逆性的研究。利用农杆菌侵染的方法将LpPEX7转入拟南芥中，通过KaNa筛选和qRT-PCR鉴定出LpPEX7过表达T3代株系。在盐碱和氧化处理下，观察野生型、LpPEX7过表达株系拟南芥种子的萌发状况，LpPEX7过表达拟南芥株系种子的萌发要优于野生型种子的萌发，初步说明LpPEX7基因过表达增加了拟南芥种子对盐碱和氧化逆境的抗性，但LpPEX7基因在植物种子中通过什么样的途径来提高过表达植株种子的抗性，还有待进一步的研究。

本研究在克隆出细叶百合LpPEX7基因及对该基因进行详细的生物信息学研究的基础上，分析了在不同器官和不同盐碱逆境下细叶百合中的mRNA表达特性，对野生型和基因过表达拟南芥种子的抗逆性表型方面进行观察。为了解LpPEX7基因与盐碱、氧化逆境的应答关系，为细叶百合的耐盐碱性分子机理研究提供重要的候选基因奠定基础。