人参皂苷Rg5调控lncRNA-PCAT12抑制胃癌细胞生长实验研究*

卓少华，丘远聪，郑俊德，殷 蕾，王惠颖

1.广东省惠州市第一人民医院药学部(惠州 516003)；2.惠州卫生职业技术学院(惠州 516001)； 3.广东省蕉岭县人民医院(蕉岭 514100)

胃癌是一种常见癌症，每年有738 000多人死于胃癌，并且全球有一半的胃癌患者发生在我国[1-2]。目前，已经有多种治疗策略可用于治疗胃癌患者，例如使用化学疗法、放射疗法或两者结合。尽管早期胃癌的治疗已有进展，但预后仍然很差，并且有很多患者死于胃癌复发[3]。

近年来，天然产物化合物由于其有显著的抗癌效果和较小的副作用，已经引起了肿瘤研究工作者的极大兴趣[4]。人参皂苷Rg5是一种从人参中提取出来的二醇类三萜皂苷，具有诱导细胞凋亡、增殖和迁移的能力[5-6]。其中Rg5表现出对肿瘤细胞增殖、转移的抑制，并且能诱导肿瘤细胞凋亡。非编码lncRNA-PCAT12 (lncRNA-PCAT12)是一种长度≥200 nt的RNA，在肿瘤细胞增殖与迁移过程中扮演重要角色[7]。研究发现lncRNA-PCAT12参与胃癌细胞浸润、转移过程，但是鲜有报道关于其作用的具体机制[8-9]。此次研究是为了进一步探究人参皂苷Rg5通过调控lncRNA-PCAT12表达，从而抑制胃癌细胞生长的药用意义。

材料与方法

1 材 料 从中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)采购人胃癌细胞株SNU-1细胞；从奥贝乐生物科技公司购买人参皂苷Rg5；从广州生物硕恒科技有限公司购买胎牛血清和RPMI-1640培养基;从南京卡米洛生物工程有限公司购买Annexin V FITC/PI细胞凋亡试剂盒。

2 细胞分组与处理 在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养人胃癌细胞SNU-1，培养箱参数设为37 ℃，5% CO2。对各组细胞分组处理，空白组加入DMEM培养基8 ml，人参皂苷Rg5低、中、高浓度组分别加入含人参皂苷Rg5 0.03，0.06，0.09 μmol/L的DMEM培养基8 ml(A组、B组、C组)，对照组不做处理。

3 采用MTT法检测细胞增殖 药物处理细胞时间节点设为24、48、72 h，每次时间处理完成后，把各组细胞种植在96 孔板中，种植密度设为6 ×103个细胞/孔。接着在每一孔中加入28 μl 0.5 mg /ml MTT溶液，然后连续培养6 h，再加入DMSO。培养完成后，震荡8 min，于530 nm波长处用酶标仪检测光密度值，从而得到增殖活性。

4 采用Annexin-FITC双染法检测细胞凋亡 药物处理细胞时间节点设为24 、48和72 h，将各组细胞种在6孔培养板，细胞密度设置为6×105/ml。在各组细胞中取出200 μl细胞悬液，按照顺序依次加入10 μl Annexin-FITC和10μl PI锭(浓度为20 μg /ml)，然后重悬细胞，使用流式细胞仪测出各组细胞的凋亡率。

5 采用细胞划痕实验检测细胞迁移 对各组细胞处理48 h后，将各组细胞种在6孔培养板(106个/孔)，然后放置在培养箱中培养过夜(37 °C，5% CO2)。使用无菌枪头在培养皿中均匀划痕，然后使用PBS(1×)洗涤细胞4次，将各组细胞加入培养基后拍照记录，此时定义时间为0 h时各组细胞的迁移状况。继续放置在培养箱中，24 h后显微镜下观察并且拍照记录，求出两次记录间的划痕距离，即认为是相应组别细胞的迁移能力。

6 采用RT-PCR检测lncRNA-PCAT12表达水平 药物处理细胞时间节点设为24、48、72 h，每次完成处理后收集各组细胞，使用Trizol法提取总RNA。以β-actin作为内标，采用RT-PCR检测lncRNA-PCAT12在各组细胞中表达水平。使用引物如表1所示，上述实验重复6次。

表1 RT-PCR所用引物序列

结 果

1 人参皂苷Rg5抑制lncRNA-PCAT12表达 使用人参皂苷Rg5按不同浓度在不同时间节点处理各组细胞后，实验组(A组、B组和C组)中lncRNA-PCAT12的表达水平都低于对照组(P<0.05)；C组中lncRNA-PCAT12的表达水平最低，都小于A组和B组(P<0.05)。见表2。

表2 三组处理后不同时间点的lncRNA-PCAT12相对表达量对比

2 人参皂苷Rg5抑制胃癌细胞增殖 处理后24、48、72 h，实验组(实验1组、实验2组和实验3组)中胃癌细胞的增殖能力都低于对照组(P<0.05)；实验3组中癌细胞增殖能力最弱，增殖指数均小于实验1组和实验2组(P<0.05)，见表3。

表3 三组处理后不同时间点的细胞增殖指数对比(%)

3 人参皂苷Rg5促进胃癌细胞凋亡 在使用不同浓度人参皂苷Rg5处理各组胃癌细胞24、48、72 h后，检测各组细胞凋亡率。实验组(A组、B组和C组)细胞凋亡率高于对照组(P<0.05)，C组中细胞凋亡率最高，均高于A组和B组(P<0.05)。见表4。

4 人参皂苷Rg5抑制胃癌细胞迁移 细胞划痕实验结果显示，实验组(C组、B组和A组)迁移距离均小于对照组(90.53±5.61)μm (P<0.05)，C组中细胞迁移距离最短(18.49±1.63)μm，均小于A组(43.60±6.12)μm和C组(22.11±4.29)μm (P<0.05)。

表4 三组处理后不同时间点的细胞凋亡率对比(%)

讨 论

目前普遍认为细胞的恶性增殖是癌症发生的必要环节，近年来对胃癌的研究发现，lncRNA通过调控核心基因的表达量，能显著抑制癌细胞增殖迁移，并促进其凋亡[10-11]。胃为“气血生化之源”和“水谷之海”，若长期饮食不节、血瘀内结，可导致脾胃功能失常，导致胃癌的发生[12]。从人参皂苷中可以分离出Rg5，近来研究表明人参皂苷Rg5可显著抑制癌细胞生长[13]。本研究发现人参皂苷Rg5可显著抑制胃癌细胞增殖迁移，促进胃癌细胞凋亡，这将为利用人参皂苷Rg5 治疗胃癌提供可靠参考。

lncRNA-PCAT12存在于细胞核中，它主要参与染色体修饰、转录沉默、转录激活等重要生理功能。因为它对疾病的发生、发展及治疗有重要作用，人参皂苷Rg5具有非常广阔的临床应用前景[14]。科学研究发现，lncRNA-PCAT12在骨肉瘤组织中表达升高，如果对lncRNA-PCAT12进行抑制，癌细胞的增殖和侵袭能力会明显下降。此外，在胰腺癌中，过表达的lncRNA-PCAT12会激活ATM-E2F1信号通路让癌细胞的迁移和侵袭能力显著升高[6]。近期研究表明，lncRNA-PCAT12在肝癌组织中的表达上调，并且lncRNA-PCAT12的表达水平与肝癌患者不良预后密切相关，但目前关于其在胃癌中参与的分子机制、药物敏感性却鲜有探究[15]。本研究显示，处理后24、48、72 h，对照组中lncRNA-PCAT12的表达水平、细胞增殖指数都高于实验组，而C组是各组中胃癌细胞受抑制最明显的实验组，说明人参皂苷Rg5能抑制胃癌细胞增殖，而且抑制能力与使用人参皂苷Rg5的剂量显著相关。

总之，本次实验发现了人参皂苷Rg5能通过调控lncRNA-PCAT12的表达抑制胃癌细胞增殖迁移，促进胃癌细胞凋亡，这为治疗胃癌提供了新的药物选择。