清热化瘀方通过调控自噬相关基因P62/LC3保护大鼠脑缺血再灌注损伤*

胡跃强，陈 炜，祝美珍，梁 妮，吴 林，唐 农△

1.广西中医药大学第一附属医院 (南宁 530023)；2.广西中医药大学(南宁 530001)

最近的研究结果提示，自噬在脑缺血再灌注损伤(Ischemia/reperfusion,I/R)过程中发挥重要的作用。在自噬过程中，自噬因子如LC3、P62调节自噬的强度和持续时间，近年来受到广泛的关注[1]。P62与LC3的直接作用招募自噬体降解聚集蛋白并引起自噬激活[2]，但其在脑I/R损伤中的信号调控机制鲜见。清热化瘀方是治疗脑梗死有较好疗效的中药复方制剂[3]，前期研究证实其有抗内质网过度应激的作用，由于内质网应激和自噬密切相关[4]，因此我们试图探讨本方可能通过调节自噬发挥神经保护作用。本研究即是通过探讨该方对P62和LC3表达的影响，以进一步阐明其抗脑缺血损伤的机制。

材料与方法

1 实验材料

1.1 药物制备：①清热化瘀方：由水牛角、生牡蛎各30 g，丹参、赤芍各15 g，地龙、石菖蒲、郁金、川芎、天竺黄各10 g，酒大黄6 g等药物组成，单味中药浓缩颗粒剂由江阴天江药业有限公司提供(批号：0904099)。②清开灵颗粒：由哈尔滨一洲制药厂制备(国药准字Z10930010)。

1.2 动物分组及动物饲养：雄性SD大鼠160只，SPF级，体质量250～300 g(合格证号：SCXK2016-0002)。将大鼠采用随机数字表法分为4组:即假手术组(Sham-operation，SO)、模型组(Ischemia/reperfusion,I/R)、清热化瘀颗粒组(Qingre Huayu,QRHY)和清开灵颗粒对照组(Qingkailing,QKL)。每组按再灌注后处死的时间点再分为12 h、1 d、2 d、3 d 四个亚组(n=10)。各组大鼠分别作如下处理：SO 组：以假手术代替缺血再灌注；I/R组：动物行大脑中动脉梗阻 2 h，再灌注后规定时间点处死；造模后灌胃等体积的生理盐水；QRHY 组:在制作大鼠模型前 30 min予以QRHY颗粒溶液灌胃14 g/(kg·d)，在造模麻醉清醒后 1 h 继予该颗粒灌胃，每天上、下午各 1 次；QKL 对照组：在制作大鼠模型前 30 min予以QKL颗粒溶液灌胃 20 g/(kg·d)，在造模麻醉清醒后 1 h 继予该颗粒灌胃，每天上、下午各 1 次。动物灌胃浓度及等效剂量按人和动物间体表面积比值表折算获得。

1.3 主要试剂：总RNA 提取试剂盒(北京天根公司)；PCR反应试剂盒及逆转录试剂盒Trizol reagent(日本Takara)；引物及内参(桂林恒顺公司)；小鼠抗大鼠 P62及兔抗LC3单克隆抗体(英国Abcam)；羊抗小鼠或兔 IgG二抗(北京中杉公司)。

1.4 造模方式：采用Longa’s法并加以改良。大鼠术后2 h将尼龙线轻轻拔退约2 cm，此时记为再灌注0 h，假手术插线深度为9 mm。术后单笼饲养，进食颗粒食物。取脑时发现有蛛网膜下腔出血及提前死亡的大鼠予以剔除。

2 实验检测方法

2.1 电子透射显微镜观察：神经元自噬及形态学改变将大鼠右侧海马分离，切割成约1 mm3大小，固定于2.5%戊二醛溶液中。0.01 mmol/L磷酸缓冲液漂洗3次，后固定于1%锇酸缓冲液中2h，再予50%丙酮脱水10 min、浸透，然后包埋、切片及柠檬酸铅与醋酸铀双重染色染色。最后H-600型透射电子显微镜(日本日立)摄片观察。

2.2 荧光定量PCR检测：P62和LC3 mRNA表达变化①按TRIzol提取细胞总RNA，合成cDNA；②目的基因引物序列： P62：上游引物5’- ACCCATCCACAGGTGAA CTC-3’；下游引物 5’-GTGGG AGATGTGGGTACAGG-3’；LC3：上游引物5’-GCAGCCT GGATGTTCAGAAT-3’，下游引物 5’- TGGATTGCCTGAGACTCCTT-3’；β-actin：上游引物TGTCACCAA CTGGGA CGATA；下游引物GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA；③反应条件：反应体系均为10 μl，在 DNA Engine Opticon TM 2 连续荧光检测系统中进行扩增反应。PCR反应条件为：96 ℃ 4 min，然后3步反应：94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共进行40个循环，第3步72 ℃ 30 s收集荧光信号，同时扩增β-actin做内参照。⑤结果处理：ΔΔCT法：A=CT(目的基因)-CT(内标基因)，B=CT(目的基因)-CT(内标基因)，K=A-B，表达倍数=2-K。ΔCT值与mRNA表达量成反比，即ΔCT值越小，表明mRNA表达量越多。

3 Western blot检测P62和LC3蛋白表达测定①标本的制备：在SDS上样缓冲液中裂解大鼠缺血半暗带组织； ②SDS-PAGE电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE；③转膜：恒流1 mA/cm2，转移1.5 h。将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50 s后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰。④杂交：用0.01 M PBS洗膜，5 min×3次。加入稀释好的鼠抗P62和LC3一抗，4℃ 放置12 h以上。然后加入辣根过氧化物酶偶联的二抗，室温2 h。最后加入显色液。⑤检测：增强化学发光检测(ECL)。⑥结果处理：获取各组免疫印迹条带的平均吸光度(A)值，内参为β-actin，目的蛋白的相对值=目的蛋白/内参A值。

结 果

1 各组脑组织超微结构变化 SO组大鼠神经元结构完整，未见细胞自噬结构；I/R组大鼠神经元线粒体肿胀，可见空泡样变性，部分内质网及嵴破裂，并见不同程度自噬溶酶体形成(见红色箭头)，胞核染色质固缩；部分神经元出现凋亡改变，核染色质形成半月状的或结节状的团块附着于核膜下，核膜碎裂；QRHY干预后较I/R组神经元细胞器损伤明显减轻，自噬及凋亡程度显著降低(图1)。

图1 各组2d透射电镜染色结果(×15000)

2 各组P62 mRNA表达变化SO组有少量P62 mRNA表达 I/R组大鼠脑缺血再灌注缺血半暗带P62 mRNA表达于1 d时最低(P<0.01)，随再灌注时间点延长其表达仍维持较低水平 (P<0.05)；与I/R组比较，QKL能明显升高各时间点其表达水平 (P<0.05)；QRHY能较QKL进一步升高各时间点其表达水平 (P<0.05)。见表1。

表1 大鼠缺血半暗带P62 mRNA表达的ΔCT比较

注：与 SO 组比，#P<0.05,▲P<0.01;与I/R组比,*P<0.05;与QKL组比，ΔP<0.05,◇P<0.01

3 各组P62蛋白表达变化 SO组可检测到较弱的P62蛋白表达，I/R组大鼠脑缺血再灌注缺血半暗带P62蛋白12 h开始降低，于1 d时最低(P<0.01)，随再灌注时间点延长其表达仍维持较低水平(P<0.05)；与I/R组比较，QKL能明显升高各时间点其表达水平 (P<0.05)；QRHY能较QKL进一步升高各时间点其表达水平 (P<0.05，P<0.01)。见表2和图2。

表2 各组P62蛋白表达的OD值比较

注：与SO组相比，#P<0.05,▲P<0.01;与I/R组相比，*P<0.05;与QKL组比较，ΔP<0.05

4 各组LC3 mRNA表达变化SO组有少量LC3 mRNA表达；I/R组大鼠其表达1d到达高峰(P<0.01)，随再灌注时间延长其表达逐渐下降，但3 d时仍维持较高表达水平(P<0.05)；与I/R组比较，QKL能明显降低各时间点其表达水平 (P<0.05)；QRHY能较QKL进一步降低各时间点其表达水平 (P<0.05)。见表3。

5 各组LC3蛋白表达变化 假手术组可检测到较弱的LC3蛋白表达，模型组大鼠脑I/R损伤12 h其表达开始升高，1 d时达到高峰(P<0.01)，其后表达渐趋下降，但3 d时仍维持较高水平表达 (P<0.05)；清开灵能明显降低各时间点其表达水平 (P<0.05)；清热化瘀方能较清开灵进一步降低各时间点其表达水平 (P<0.05)。见表4和图3。

表3 各组LC3 mRNA表达变化比较

注：与 SO 组相比,#P<0.01；与I/R组相比,*P<0.05；与QKL组相比，ΔP<0.05

表4 各组 LC3蛋白表达的OD值比较

注：与SO组相比，#P<0.01；与I/R组相比,*P<0.05；与QKL组相比，ΔP<0.05

图2 各组P62蛋白的表达图(Western blot)

图3 各组LC3蛋白的表达图(Western blot)

P62作为一种自噬底物，是自噬的首选靶位，在选择性自噬过程中起重要作用，是最先发现并被广泛研究的自噬负荷物受体，同时它参与多种细胞信号转导调控及自噬过程，在对抗氧化应激及线粒体凋亡等方面起着重要的作用[5]。它可以直接和微管结合蛋白轻链3(LC3)相结合，通过N端再与定位于自噬小体内膜上的 LC3-II 蛋白形成复合物，一同在自噬溶酶体内降解并引起自噬[6-7]。出现自噬时，在细胞质中 P62 蛋白不断被降解；当自噬活性减弱或功能缺陷时，P62 蛋白会在细胞质中不断累积[8-9]。微管相关蛋白轻链3(LC3)在自噬体和溶酶体膜上存在，其表达量的多少可以间接反映自噬体和溶酶体的多少，由此可将LC3 看作自噬体体形成的关键分子[10]。许多研究表明，在包括低氧缺血、局灶性或全脑缺血动物模型中，自噬能够在神经元中被诱导，且神经元的凋亡可能受自噬调节[11-13]。但有关P62/LC3介导的自噬信号通路在脑缺血损伤中的调控机制鲜有研究。因此，探讨其在脑缺血损伤中的作用，可为脑保护治疗提供新靶点和新思路。

我们认为中风病病变的核心在于“脑络”，其病机的核心是气血逆乱。主要的病机是痰瘀阻滞脑络，痰淤郁久化热，继而产生各种毒性物质，引发脑髓受损加重。由于痰瘀火热密切相关，故痰毒、瘀毒、热毒往往交织为患，故认为淤痰热毒并治抗急性脑缺血损伤是提高中风疗效的关键和重要策略[14]。针对以上病机， 本课题组提出“清热解毒，化瘀通络”的治则治法，使毒邪去则络脉不再受损而易复，络通则气血畅，神机自复。具有解毒、化痰祛瘀之功效的解毒化瘀方可能正是根据这一思想所创制。前期研究证实其可以显著减轻内质网应激反应，减少神经元凋亡等神经保护作用[15-16]。基于该方前期的抗内质网应激效应，我们推测其可能通过P62介导的信号通路发挥调控细胞自噬的作用。

本研究结果显示脑缺血再灌注损伤后，P62表达明显下调，而LC3表达明显上升，这表明脑缺血损伤后细胞自噬明显加剧，而过度激活的自噬可引起细胞裂解而死亡，即自噬性细胞死亡[17-18]。清热化瘀方可能正是通过升高P62的表达以及减少LC3的表达从而抑制自噬的过度激活，发挥神经元保护的作用。