婴幼儿肺泡灌洗液中肺炎克雷伯菌对β-内酰胺类抗生素的耐药变迁

邓文喻，陈国洋，麦荣嘉，穆小萍(广东省妇幼保健院检验医学科，广州 510010)

婴幼儿由于免疫功能不成熟极易受致病菌的感染，容易引发严重疾病导致死亡。呼吸道感染而致的婴幼儿肺炎是婴幼儿死亡的主要疾病之一[1,2]。 肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，KP)是最重要的呼吸道致病菌之一，可引起典型的原发性肺炎，该菌容易产生超广谱β-内酰胺酶(extended spectrum beta-lactamases，ESBLs)，导致医院常用的β-内酰胺类抗生素失去效用[3]。由于肺泡灌洗液检查结果具有高度的敏感度与特异度，同时其检出菌的药敏结果与耐药变迁对临床用药更有指导意义[4]。因此，本文回顾性分析2015～2018年间医院婴幼儿肺泡灌洗液中分离的肺炎克雷伯菌，分析菌株的ESBLs检出率，以及菌株对β-内酰胺类抗生素的耐药情况与耐药变迁，为临床合理用药以降低婴幼儿群体肺炎克雷伯菌对抗生素耐药性的产生提供实验室依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 本实验收集自2015年1月～2018年12月广东省妇幼保健院微生物室569例婴幼儿(0～1岁)肺泡灌洗液阳性标本，其中肺炎克雷伯菌117例。

1.2 试剂和仪器 Vitek2 Compact型全自动微生物分析仪、 GN鉴定卡、 AST-GN13药敏卡由梅里埃诊断产品有限公司生产。血平板、嗜血杆菌巧克力平板均购自广州市迪景微生物科技有限公司。

1.3 方法 采用法国生物梅里埃的Vitek2-Compact全自动微生物鉴定及药敏分析系统进行细菌鉴定和药敏鉴定试验，使用GN鉴定卡与GN13药敏卡，严格按照美国临床实验室标准协会 (CLSI)2018年制定的标准判读结果。质控菌株为肺炎克雷伯菌ATCC35218，铜绿假单胞菌ATCC27853，大肠埃希氏菌ATCC25922。ESBLs表型确证试验使用两对复合试剂：头孢噻肟(CTX)与头孢噻肟/克拉维酸复合制剂(CTX/CA)；头孢他啶(CAZ)与头孢他啶/克拉维酸复合制剂(CAZ/CA)。两者中任一抗生素在加克拉维酸后抑菌圈扩大5 mm 以上时，即判ESBLs阳性。

1.4 统计学分析 数据分析采用SPSS 22.0 统计软件，产ESBLs 比例变化情况采用χ2检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺泡灌洗液培养的菌株分布 见表1。2015年1月～2018年12月肺泡灌洗液标本中共检出菌株569株，其中肺炎克雷伯菌的总检出率最高，为20.56%(117/569)，其次是金黄色葡萄球菌16.87%(96/569)、大肠埃希氏菌13.53%(77/569)、肺炎链球菌8.44%(48/569)和铜绿假单胞菌8.26%(47/569)。

表1 2015-2018年婴幼儿肺泡灌洗液的菌株分布情况

2.2 产ESBLs-KP检出ESBLs情况 见图1。2015～2018年，产ESBLs的肺炎克雷伯菌检出率分别为47.8%(11/23)，22.7%(5/22)，48%(12/25)和53.2%(25/47)。四组肺炎克雷伯菌产ESBLs的差异无统计学意义(χ2=5.83，P=0.12)。进一步对其进行2分割两两比较发现，2018年产ESBLs的肺炎克雷伯菌检出率显著高于2016年，其差异具有统计学意义(χ2=5.66，P=0.017)。

2.3 肺炎克雷伯菌对抗生素的耐药率 见表2。肺炎克雷伯菌对三代头孢类抗生素如头孢曲松、头孢他啶和四代头孢如头孢吡肟的耐药率呈持续增长趋势，其中2018年上述头孢类抗生素的耐药率分别为74.47%，59.57%和59.57%，肺炎克雷伯菌对头孢他啶和头孢吡肟耐药率呈上升趋势，其差异有统计学意义(P=0.003，<0.001)。四年内，肺炎克雷伯菌对于酶抑制剂类、单环内酰胺类耐药率处于较高水平，卡方趋势分析结果显示肺炎克雷伯菌对氨苄西林/舒巴坦和氨曲南的耐药趋势差异有统计学显著意义(P=0.001，0.030)。碳青霉烯类亚胺培南的耐药率峰值为2016年的31.82%，2018年亦达到19.15%。

图1 2015～2018年KP菌株数和产 ESBLs-KP检出率

3 讨论

研究表明，随着疾病感染率的升高，抗生素的使用数量和使用频率亦随之增加。由于自身免疫力和解毒能力仍未完善，因此对于药物毒副作用较大的抗生素如可导致肾毒性、影响骨骼发育和引起手脚部位的神经损伤等的氨基糖苷类和喹诺酮类抗生素，国家限制其在婴幼儿群体中使用[5,6]。由于β-内酰胺类抗生素安全性好，且经过成熟的论证，因此国内医院目前主要使用β-内酰胺类抗生素治疗婴幼儿肺炎，其中大多数是三代头孢菌素。近年来国内随着 β-内酰胺类抗生素的广泛应用，致使革兰阴性杆菌尤其是肺炎克雷伯菌出现了不同程度的多重耐药性，从而导致肺炎克雷伯菌引起的婴幼儿医院感染率逐年升高[7]。

表2 KP对β-内酰胺类抗生素的耐药率(n=117)

随着致病菌抗生素耐药性的增加，由于耐药性细菌导致感染性疾病的发病率和死亡率亦不断攀升，由此对全球经济和社会造成沉重的负担。此外，由于致病性细菌大多呈多重耐药模式，传统的抗生素如头孢菌素等治疗致病病原体变得越来越难。同时，由于很多医疗机构未能及时对致菌血症和其他严重感染等的病原微生物进行鉴定和抗生素药物敏感试验，大量的广谱抗生素被不必要的滥用，导致抗生素耐药性越来越严重。本研究结果显示，从住院患儿中分离出的大多数肺炎克雷伯菌对青霉素类、头孢菌素、酶抑制剂和单环内酰胺类抗生素均呈高度耐药。对头孢曲松、头孢他啶和头孢吡肟的高耐药率是产ESBL菌株的典型表现。此外细菌耐药性增加可能与医院的用药习惯、机械通气的使用、激素的应用和细菌的耐药基因传播等相关[8]。四年间ESBL-KP的检出率高达45.3%，表明尽管头孢类抗生素仍旧是治疗婴幼儿肺炎最常用的抗生素，但常用的β-内酰胺类抗生素中，三四代头孢类抗生素的耐药率均呈上升趋势。分析其耐药机制，主是因为肺炎克雷伯菌是容易产多种耐药酶的革兰阴性肠杆菌之一，包括ESBLs，质粒介导的Amp C和碳青霉烯酶等。碳青霉烯类抗生素是有效治疗和抵御多重耐药肠杆菌的最后一道防线，但由于临床的大量使用，目前已出现产碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae,CRKP)，此为肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素敏感性下降的最主要原因。与世界范围内的其他研究一样，肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素的耐药性呈现不良的上升趋势，本文研究结果显示，亚胺培南耐药率在2018年增长至19.15%，与相关报道结果相近。编码碳青霉烯酶的基因多数可通过质粒传播，并且由于肺炎克雷伯菌其他耐药机制的协同作用，如外膜蛋白的缺失、靶位的改变、生物膜的形成，以及外排泵系统的形成等因素致肺炎克雷伯菌耐药的快速升高。自1996年首次发现耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌以来，CRKP一直是一个重要的医学问题，高耐药率的CRKP需引起临床医师及卫生行政部门的高度关注。基于碳青霉烯类抗生素(亚胺培南、美罗培南等)仍然是目前临床治疗肺炎克雷伯菌感染的最有效的抗生素，本研究认为应严格控制临床对碳青霉烯类抗生素的使用，避免出现超级耐药菌的产生。

综上所述，婴幼儿肺炎克雷伯菌的感染率呈逐年增加的趋势，且该菌对绝大部分β-内酰胺类抗生素的耐药性持续上升，临床需严格控制肺炎克雷伯菌感染，加强仪器设备、手术器械的消毒与管理以及减少有创操作的实施，并且严格控制临床对抗生素的使用。临床医生应根据WHO抗生素使用原则，掌握区域内细菌的耐药性与分布特点，结合临床实际情况选取合适的抗生素。检验人员应尽可能快速发出药敏报告，临床医生应根据药敏报告和临床情况选择合适的抗生素，减缓耐药性产生。