CIM，mCIM和MHT筛选肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶的方法评价

曹 蕾，李小月 ，罗庆礼 ，王亚平

(1.安庆市第一人民医院检验科，安徽安庆 246003；2.安徽医科大学病原生物学教研室，合肥 230000)

近年来，耐碳青霉烯的肠杆菌(carbapenem-resistant Enterbacteriaceae，CRE)引起了广泛关注，而产碳青霉烯酶是引发耐药的主要机制[1]。有报道显示，产碳青霉烯酶的CRE(carbapenemase-producing carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CP-CRE)比非CP-CRE毒力、致病力更强[2]，并能通过耐药质粒引起播散。明确CP-CRE诊断，有利于感染的控制和播散。因而，一种高效、简便、准确筛选碳青霉烯酶的方法尤为重要。

本实验选取三种操作简便、无需特殊仪器的方法：改良Hodge试验(modified Hodge test, MHT)，碳青霉烯类失活法(carbapenem inactivation method，CIM)和改良碳青霉烯类失活法(modified carbapenem inactivation method，mCIM)，结合本地区肠杆菌细菌耐药情况，以PCR作为金标准，评估三种方法的表型筛选能力。

1 材料和方法

1.1 研究方向 收集安庆地区2013年01月～2017年12月临床分离的肠杆菌科细菌，挑选120株CRE，即对亚胺培南的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)≥4，其中肺炎克雷伯菌73株，大肠埃希菌24株，阴沟肠杆菌9株，产气肠杆菌5株，弗氏枸橼酸杆菌5株和黏质沙雷菌4株。50株碳青霉烯类敏感的肠杆菌科细菌中大肠埃希菌30株，肺炎克雷伯菌20株。

1.2 试剂与仪器 全自动微生物分析仪VITEK 2 Compact及配套板卡，哥伦比亚血琼脂、水解酪蛋白培养基(法国生物梅里埃公司)；药敏纸片(英国Oxoid公司)；PCR扩增仪、凝胶成像仪和电泳仪(美国伯乐公司)； 2×Es Taq MasterMix(北京康为世纪公司)；50×TAE，琼脂糖和胰蛋白胨大豆肉汤(Tryptic soy broth,TSB)(上海生工生物公司)，引物由大连宝生物公司合成。

1.3 方法

1.3.1 碳青霉烯酶表型的检测：分别参照文献[3-5]进行CIM，mCIM和MHT试验及结果判读。

1.3.2 碳青霉烯酶基因检测：采用加热煮沸法提取菌株 DNA 作为 PCR模板。参照文献[6]合成碳青霉烯酶基因 blaKPC ，blaNDM，blaVIM，blaIMP，blaGES，blaOXA-48和blaOXA-23引物。 PCR扩增体系 20μl：上、下游引物( 10mmol / L) 各 1μl，2×Taq Master Mix 10μl，ddH2O 7μl，模板 1μl。PCR扩增参数: 95 ℃ 5 min; 95 ℃ 30 s，56 ℃30 s，72 ℃ 1 min，共 30 个循环; 72 ℃7min。扩增产物经 12 g / L 琼脂糖凝胶电泳观察结果。PCR扩增阳性产物由大连宝生物公司进行双向测序，测序结果经 BLAST 比对分析以确定基因型。

1.4 统计学分析 采用SPSS22.0软件进行统计学分析，分别计算CIM，mCIM和MHT的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值，并进行一致性分析，分别计算CIM， mCIM，MHT和PCR结果的一致率和kappa值。kappa值在0.41～0.60之间，表示一致性强度中等，kappa值在0.61～0.80之间，一致性强度为高度；kappa值在0.81～1.00之间，一致性强度为完全一致。

2 结果

2.1 耐药基因检测结果 见表1。120株CRE中，93株携带一种或多种耐药基因，27株未检出耐药基因。除blaGES基因外，其他基因型均有检出。50株碳青霉烯类敏感的肠杆菌科细菌未发现基因型。

表1 PCR,CIM,mCIM 和MHT试验阳性结果分布(株)

2.2 CIM,mCIM 和MHT试验结果 120株CRE中，CIM试验阳性87株，阴性33株；mCIM 试验阳性94株，阴性26株；MHT试验阳性72株，阴性48株。三种方法筛选碳青霉烯酶，差异有统计学意义(χ2=12.796，P<0.05)。50株碳青霉烯类敏感的肠杆菌科细菌三种方法均阴性。

2.3 三种方法性能评价 见表2。以PCR结果作为金标准，对三种方法检测CRE的性能进行评价，mCIM试验的敏感度、特异度和阳性预测值均高于另外两种方法。与PCR结果相比较，CIM，MHT和mCIM的一致率分别为90%，95%和77.4%，Kappa值分别为0.898，0.949和0.771。mCIM和CIM试验与PCR高度一致。

表2CIM,mCIM和MHT试验检测CP-CRE性能评价

评价指标CIMmCIMMHT敏感度(%)95.696.895.8特异度(%)72.792.350阳性预测值(%)90.397.874.2阴性预测值(%)88.988.988.9一致率(%)909577.4Kappa值0.8980.9490.771

3 讨论

临床微生物实验室快速准确地检测CP-CRE的能力，是有效控制和预防病原菌播散的重要因素，也是实验室管理的一个至关重要的组成部分[7]，肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶是导致耐药的主要机制，该酶常处于可移动的质粒上，细菌通过转移耐药质粒将耐药性传递给其他菌株引起播散。因而，对碳青霉烯酶的快速检测将有利于临床及早采取隔离措施，避免耐药菌的进一步播散。实验室快速鉴定CP-CRE是控制其扩散的重要一环，约有55%的实验室使用PCR的方法来进行鉴定，但耐药基因检测也存在一些缺陷，对实验室条件、人员、技术要求较高，同时也会受检测的基因数量，引物突变等因素的影响而出现假阴性[8]，本研究中就有三株细菌，CIM,mCIM 和MHT试验均阳性，但未检测到试验中扩增的这6种基因型，原因可能是因为CRE耐药基因多样，而研究中选择扩增的基因有限。也可能是操作失误或是引物突变而出现的假阴性，具体原因仍需实验论证。虽然目前PCR检测耐药基因仍旧是金标准，是流行病学监测和感染防治的基础，但是，基因检测有其不能避免的缺点，因而，仍需要一种快速经济的表型检测方法。表型检测提供了一种成本效益高的筛选过程可快速区分CP-CRE和非CP-CRE，避免不必要的分子检测，且不受已知基因突变或分子靶点数量的限制[9]，也无需特殊仪器，人员要求不高，有利于基层实验室中开展。

本研究发现，mCIM试验敏感度、特异度和一致率高于CIM试验，与其他国内外相关报道一致[10-11]。CIM试验是由VAN DER IWALUW等[3]在2015年提出的一种操作简便、成本低廉、敏感度高的检测方法，2017年CLSI改良该方法-mCIM正式纳入标准，用于流行病学调查和感控研究。mCIM试验用TSB替代生理盐水，并将孵育时间延长至4 h，更有利于细菌的生长，产酶量更充足、水解更充分，同时，可以增强对水解活性较弱、表达水平较低的或需要二价阳离子才能激活的金属酶(B组耐药基因)的检测，使得敏感度更高[12-13]。TAMMA等报道[14]，CIM试验在blaKPC,blaNDM 和blaOXA-48基因型上敏感度不及mCIM，本研究中发现mCIM对blaKPC,blaNDM敏感度可达100%。且mCIM试验不受菌龄、药敏纸片以及细菌是否产黏液影响，使其敏感度和特异度更好。但mCIM试验在结果判读中存在一个不确定的范围，即与待测细菌菌液共孵育的美罗培南纸片，若其抑菌圈直径为16～18mm，则需要再次验证，易导致实验结果的误判。目前，mCIM试验仅被CLSI推荐用于CRE的检测，但是耐碳青霉烯的其他细菌(如：铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌)日益增多，其在这些细菌表型检测中的意义如何，仍需更多试验证实。

与mCIM试验相比，MHT步骤更为简单，耗时短，并且对于A 组(如：blaKPC)和D组(如：blaOXA-23)碳青霉烯酶显示较好的检测能力，但是对于B组金属酶(如blaNDM，blaVIM，blaIPM)的检测存在缺陷，造成该实验总体的敏感度低于其他两种方法，也低于相关报道[15]。另外，研究中发现有两株未检测到基因型，且另两种方法均阴性的菌株，MHT试验阳性，有文献报道细菌产ESBLs或者存在高水平的AmpC酶，会导致结果出现假阳性[16-17]。

相比较而言，mCIM试验检测CP-CRE的性能均高于CIM和MHT，可作为合适的碳青霉烯酶表型筛选试验。