MALDI-TOF MS方法快速鉴定临床分离的肺炎克雷伯氏菌

姜彦芬，王金凤，李睿文，孙晓霞，袁万哲，王建昌

（1.石家庄海关技术中心，河北石家庄 050050；2.河北农业大学动物医学院，河北保定 071001）

肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae，Kp）是一种重要的条件性致病菌，属于肠杆菌科克雷伯氏菌属，分为3个亚种：肺炎克雷伯氏菌（K.peneumoniae）、臭鼻克雷伯氏菌（K.ozaenae）和鼻硬结克雷伯氏菌（K.rhinoscleromatis）[1]。肺炎克雷伯氏菌在自然界广泛存在，可引起人和多种动物的肺炎、腹泻、脑膜炎、腹膜炎，泌尿系统感染及败血症等，同时还可以污染食品，造成食品中毒[2-4]。近年来，肺炎克雷伯氏菌引起的动物疫情不断增多，已成为危害我国养殖业的重要病原之一[5-7]。

目前，国内外对肺炎克雷伯氏菌检测主要采用传统生化鉴定方法和分子生物学方法。传统生化鉴定方法操作繁琐、周期较长，对技术人员要求较高，同时鉴定结果受细菌生长状态、生化试剂质量等多个外部因素影响。近年来，用于肺炎克雷伯氏菌检测和鉴定的分子生物学方法较多，主要有16SrRNA测序、普通PCR、实时荧光PCR、环介导等温扩增和重组酶聚合酶扩增等方法。这些方法对于该菌引起的动物疫情防控和食品污染控制发挥了重要作用[4，8-10]。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-offlight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）是 近年来发展起来的一种新型微生物快速鉴定技术，也是近年来临床微生物鉴定领域最具代表性的技术之一。其基本原理是，将样品与基质在靶板上形成共晶体，基质从激光中吸收能量使样品解吸附，基质与样品之间发生电荷转移，使样品分子电离，经过飞行时间检测器后，将不同质荷比（m/z）的离子分开，形成特异性肽/蛋白质指纹图谱[11]。每种微生物都有其自身独特的肽/蛋白质组成。MALDITOF MS主要通过分析待测微生物的特征蛋白指纹图谱，并与数据库中标准菌株特征蛋白指纹图谱进行比对，从而实现微生物的快速鉴定[11]。同传统微生物生理生化鉴定方法相比，MALDI-TOF-MS方法具有操作简单、快速、准确、高通量和成本低等优点[12]。目前MALDI-TOF MS已被广泛应用于食源性致病菌、医学临床微生物和兽医临床微生物的快速鉴定。本研究对从体温升高、严重呼吸道症状并死亡的绵羊肺脏中分离到1株病原菌，通过MALDI-TOF MS方法将其快速鉴定为肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种。

1 材料与方法

1.1 试剂与设备

血琼脂平板培养基、胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA），购自北京陆桥技术股份有限公司；甲酸（Formic acid，FA）、三氟乙酸（Trifluoroacetic acid，TFA）、乙 腈（Acetonitrile，ACN）、无水乙醇，均购自赛默飞世尔科技有限公司；α-氰基-4-羟基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid，CHCA）和细菌实验标准品（bacterial test standard，BTS），购自德国布鲁克公司；VITEK2阴性菌鉴定卡（GN），购自法国生物梅里埃公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；T-Vecter pMD19（Simple），购自宝生物生物工程（大连）有限公司；GoTaq®Green Master Mix 2×、Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System，购自美国Promega公司。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（Autoflex speed TOF/TOF），德国布鲁克公司生产；全自动微生物鉴定系统VITEK2（compact），法国生物梅里埃公司生产；PCR扩增仪（Bio-rad，C1000型），美国伯乐公司生产。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离与纯化 采集发病死亡羊的肺脏，用接种环划线接种于血琼脂平板，37 ℃培养24 h后观察菌落生长情况；挑取典型菌落划线接种于TSA培养基，37 ℃培养24 h以获得单菌落；挑取纯培养单菌落进行革兰氏染色，观察细菌形态，并进行后续菌种鉴定。

1.2.2 MALDI-TOF MS鉴定

1.2.2.1 溶液配制 按乙腈:三氟乙酸:无菌去离子水体积比50:2.5:47.5的比例配制基质溶剂；按照试剂配制说明，使用基质溶剂配制CHCA基质溶液和BTS标准品溶液。

1.2.2.2 样品前处理和点样 使用甲酸提取法进行待测细菌蛋白前处理。取TSA平板上3～5个细菌单克隆，重悬于300 μL去离子水中，混匀；加入900 μL无水乙醇，充分混匀，12 000×g离心2 min；弃上清液后继续12 000×g离心1 min；吸弃上清液，室温放置5 min干燥沉淀，然后加入50 μL 70%甲酸溶液，充分重悬细菌沉淀，再加入等体积乙腈；充分混匀后12 000×g离心2 min；取1 μL上清液点加到MALDI-TOF MS靶板上，待自然干燥后，在靶点上加1 μL CHCA基质溶液均匀覆盖；同时在靶板另一位置点加1 μL BTS标准品溶液用于仪器校正，待自然干燥后，在靶点上加1 μL CHCA基质溶液均匀覆盖；自然干燥后上机检测。

1.2.2.3 数据采集和结果鉴定 使用标准品对质谱仪校准后进行样品质谱数据采集和分析。运用FlexControl 软件采集样品数据，选择线性操作模式和正离子模式。应用BioTyper 软件将采集样品图谱与数据库中标准图谱进行比对，根据匹配度得分判定结果：分值为2.300～3.000，标记为（+++），表示菌种鉴定可信度较高，可完全确认菌株鉴定结果；2.000～2.299，标记为（++），表示可信的菌属鉴定和可能的菌种鉴定，可基本确认菌株鉴定结果；1.700～1.999，标记为（+），表示可能菌属鉴定，菌株鉴定为不确定结果；0～1.699，标记为（-），表示鉴定结果不可信。

1.2.3 VITEK2鉴定 挑取TSA平板上纯培养24 h后的细菌，使用3 mL 0.45% NaCl溶液制备菌悬液；使用比浊仪测定浊度，调节菌悬液在0.50～0.63麦氏浊度单位之间；使用VITEK 2阴性菌鉴定卡，通过VITEK2 compact全自动微生物鉴定系统进行分离菌鉴定。

1.2.4 16SrRNA测序鉴定 使用细菌基因组DNA提取试剂盒，提取TSA平板上分纯细菌的基因组DNA，并以之为模板进行细菌16SrRNA基因扩增，大小约为1 500 bp。PCR上游引物27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，下游引物1492R 5'-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反应体系为：GoTaq® Green Master Mix（2×）12.5 μL，27F/1492R（20 μmol/L）各0.5 μL，DNA模板2 μL，ddH2O补足至25 μL。PCR反应条件为：95 ℃ 5 min，1个循环；95 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 1.5 min，34个循环；72 ℃ 10 min。回收PCR产物并连接pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，送生工生物工程（上海）有限公司测序。登录NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），利用 Blast 程序将测序结果与数据库中的序列进行比对。

2 结果

2.1 细菌分离

培养24 h后，血平板上可见圆形、边缘整齐、不透明、灰白色菌落，粘稠，接种环挑取菌落时易拉起长丝，呈现β溶血。镜检为革兰氏阴性，单个或成对存在，为粗短状杆菌。

2.2 MALDI-TOF MS鉴定

通过MALDI-TOF-MS检测及BioTyper软件分析，以检测到的离子峰强度（intens）为纵坐标，离子质荷比（m/z）为横坐标，获得的分离菌蛋白指纹图谱基线平稳、蛋白峰多、结果良好，离子峰在5 371.5m/z左右出现的强度最高。分离菌蛋白指纹图谱具体如图1所示。通过与Bruker数据库进行比对，分离菌被鉴定为“肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种”，匹配分值为2.549，标记为（+++），表示菌种鉴定可信度高，可完全确认菌株鉴定结果，并达到了亚种水平的鉴定。数据库比对结果如图2所示。

2.3 VITEK2鉴定

根据分离菌株的48项生化反应结果，分离菌鉴定为肺炎克雷伯氏菌。

图1 分离菌株MALDI-TOF MS蛋白质指纹图谱

图2 分离菌株蛋白指纹图谱与数据库标准图谱比对结果

2.4 16SrRNA鉴定

以分离菌株基因组DNA作为模板，经PCR后可扩增出大小约为1 500 bp的目的片段。将测序结果在NCBI中进行Blast比对，发现与数据库中肺炎克雷伯氏菌的序列同源性在99.4%以上，由此鉴定为肺炎克雷伯氏菌。

3 讨论

本研究基于MALDI-TOF MS方法实现了对临床分离肺炎克雷伯氏菌的快速鉴定，这对于养殖业中逐年增多的肺炎克雷伯氏菌感染的防控具有重要意义。本研究中，从获得纯菌落到出鉴定结果，MALDI-TOF MS方法需要约30 min，VITEK2方法需要4 h左右，而16SrRNA测序方法需要对靶基因进行扩增测序，至少需要2个工作日才能得到测序和鉴定结果。同时，MALDI-TOF MS方法直接将临床分离肺炎克雷伯氏菌鉴定到亚种水平。

目前MALDI-TOF MS方法在布鲁氏菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌、爱德华氏菌、假丝酵母菌等不同种类微生物快速鉴定中得到了广泛应用[13-17]。同传统生化方法和分子生物学方法相比，MALDITOF MS方法操作简单、成本低、鉴定速度快、检测通量大，还具有良好的重复性和稳定性[18]。使用MALDI-TOF MS方法进行微生物鉴定，样品前处理较为简单，用甲酸提取法即可实现对绝大部分微生物的有效鉴定，同时在处理前无需革兰氏染色确定待鉴定微生物为革兰氏阴性或阳性。MALDITOF MS鉴定过程中，耗材成本低，无需特殊试剂，仅需少量基质（1 μL）；1块靶板1次可实现384株待测菌的高通量检测，靶板清洗后还可以重复使用；检测时间短，上机后仅需约30 s即可实现对1株待测菌的有效鉴定。梁达炜等[14]研究表明，MALDI-TOF MS方法鉴定沙门氏菌的耗材成本约为VITEK2的1/3，检测时间约为VITEK2的1/2。汪琦等[15]研究表明，MALDI-TOF MS方法对1株细菌的检测成本约为1～2元，能够在30 min内获得鉴定结果，而VITEK2则需要约30～40元，大约需要8 h。在检测时间和成本方面，本研究对肺炎克雷伯氏菌的MALDI-TOF MS鉴定结果和前述研究基本一致。MALDI-TOF MS方法对微生物的鉴定是基于对微生物胞内固定表达的高丰度核糖体蛋白的检测和分析，理论上不同的培养条件不会导致MALDI-TOF MS的鉴定结果有明显差异[18]。目前MALDI-TOF MS方法的局限性主要有两点：一是质谱仪设备成本高，难以在基层实验室普及；二是微生物数据库的完整程度和质量存在不足，导致一部分微生物无法实现准确鉴定，如难以区分大肠埃希氏菌和志贺氏菌属，无法有效区分蜡样芽孢杆菌和炭疽芽孢杆菌等[18]。随着MALDI-TOF MS方法的进一步普及和数据库的不断完善，上述不足有希望得到有效完善。

作为一种新型微生物鉴定技术，MALDI-TOF MS方法可以作为肺炎克雷伯氏菌日常检测的有效工具，同时还可以基于质谱仪自建数据库功能，对某地区或农场所分离的肺炎克雷伯氏菌进行聚类分析和分型，分析菌株之间的亲缘关系，实现对新分离肺炎克雷伯氏菌的快速准确鉴定和有效溯源。