新疆部分地区羊捻转血矛线虫系统进化与抗药性分析

肖培培，绮丽格尔，李泽华，张梦圆，吾力江，李才善，张 杨

（1.新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052；2.南京农业大学动物医学学院，江苏南京 210095）

捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）属于毛圆科、血矛属，是一种分布广泛的反刍动物胃肠道寄生性线虫，可引起捻转血矛线虫病[1]。感染反刍动物的胃肠道线虫主要是血矛线虫，而捻转血矛线虫在同类感染性线虫中对羊群的致病力最强。羔羊和青年羊对捻转血矛线虫较易感，感染后引起的发病率和死亡率最高，而成年羊对捻转血矛线虫的抵抗力较强，且感染后有“自愈”现象，即有虫体排除或不发生再感染[2]。捻转血矛线虫在我国草地牧区普遍流行，可引起宿主消瘦、贫血等慢性消耗性症状，严重感染时可引起死亡，给我国畜牧业造成巨大经济损失。由于基层养殖人员常忽视寄生线虫病的危害，缺乏基本的防控常识和驱虫意识，从而错过了预防和治疗该病的最佳时机。目前捻转血矛线虫的防控仍以药物防治为主，因而会出现抗药性、环境污染、药物残留等问题。而该病的免疫防控研究进展缓慢，目前还没有有效的疫苗用于实际生产[3-6]。

本研究对新疆博乐及塔城地区采集的羊皱胃内的线虫进行形态学鉴定及分子生物学检测，对捻转血矛线虫阳性样品进行测序鉴定对比，绘制系统进化树，同时进行多重序列比对，分析2个地区捻转血矛线虫对苯并咪唑类药物的敏感性，以期为今后制定更有效、更有针对性的防治措施提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品来源

2018年6—7月随机采集新疆塔城和博乐地区的羊皱胃32个，其中塔城地区20个（绵羊18个、山羊2个），博乐地区12个（绵羊皱胃）。对采集的皱胃进行处理并分离虫体，并装入EP管保存于实验室，-20 ℃待检。

1.2 主要试剂

EasyPure Genomic DNA kit，购自北京全式金生物技术有限公司；PCR扩增试剂，购自上海生工生物工程技术服务有限公司；无水乙醇，购自北京鼎国生物技术有限责任公司。

1.3 试验仪器

体视显微镜ST-39，购自中国迈克奥迪实业集团有限公司；旋涡混合器QL-866，购自上海圣科仪器设备有限公司；Gel Doc 2000紫外凝胶成像系统、PCR仪，购自美国Bio-Rad公司；DK-600A型电热恒温水浴锅，购自上海一恒科学仪器有限公司；RADIAL20型台式高速离心机，购自西班牙ORTO ALRESA公司。

2 方法

2.1 虫体采集

参照何添文等[7]的方法进行。镜检虫体形态后，将雌雄虫体分开保存于70%酒精中，-20 ℃保存备用。

2.2 DNA提取

按照 EasyPure Genomic DNA kit说明书进行，将提取的DNA置于-20 ℃保存。

2.3 PCR目的片段扩增

PCR引物应用薄新文[8]设计的引物合成。其引物主要根据 GenBank 发表的捻转血矛线虫β-微管蛋白（β-tubulin）基因组（登录号X67489）的第三外显子序列设计。上游引物P1：5'-CGT TCT GGA CCG TAT GGA CA-3'；下游引物P4：5'-ATG TTC ACG GCT AAC TTG CG-3'。引物由新疆昆泰锐生物技术有限公司引物合成。捻转血矛线虫PCR 反应体系（25 μL）如下：2×EsTaqMaster Mix（Dye）13 μL，上游引物、下游引物、模板DNA各1 μL，9 μL灭菌双蒸水补足体系。PCR 反应条件如下：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s（30个循环）；72 ℃ 延伸10 min。PCR反应产物进行凝胶电泳（1%琼脂糖）检测后，通过琼脂糖凝胶成像仪荧光成像观察。

2.4 系统发育分析

选取博乐地区2个捻转血矛线虫阳性样品（编号16、23），塔城地区4个样品（编号1FTTacheng、4FTTacheng、4FHTacheng、21FHTacheng）进行测序，将测序结果用BLAST进行相似性检索；选取与捻转血矛线虫同科、不同属的环纹背带线虫（登录号分别为KF483653.1、KF483647.1、KP204098.1、KP204100.1）以及不同科、不同属的羊仰口线虫（登录号为KP792295.1），应用 MEGA6.0软件，以所选择的18种线虫的β-tubulin基因为靶标（表1），以最大似然法构建进化树，并计算遗传距离进行分析；同时，对所选择的同科同种的捻转血矛线虫序列与测定序列进行序列比对分析。

2.5 抗性分析

对确定为捻转血矛线虫β-tubulin基因的6个序列（16、23、1FTTacheng、4FTTacheng、4FHTacheng、21FHTacheng）与抗苯丙咪唑标准序列（登录号X67489.1），采用序列分析软件ESPript 3和CLUSTALW进行多序列比对，分析博乐和塔城地区捻转血矛线虫抗苯并咪唑类药物的抗性。

3 结果

3.1 虫体收集

在塔城地区收集的20个羊皱胃中，从14个羊皱胃内发现寄生性线虫，共采集到85只虫体；在博乐地区收集的12个羊皱胃中，从7个羊皱胃内发现寄生性线虫，共采集到210只虫体。

表1 捻转血矛线虫及其他线虫β-微管蛋白基因

3.2 病原鉴定

将形态学鉴定初步鉴定为捻转血矛线虫的虫体提取DNA后，通过PCR检测。电泳结果显示，基因片段大小约798 bp，与预期结果一致（图1）。最终确定：塔城地区分离到的85只虫体中，有27只为捻转血矛线虫；在博乐地区分离到的210只虫体中，有55只为捻转血矛线虫。

3.3 遗传进化分析

测序所得序列与从GenBank下载序列进行比对，运用最大似然法构建系统发育树（图2）并计算遗传距离（图3）。

图1 部分样品的捻转血矛线虫PCR检测结果

图2 运用最大似然法构建的β-tubulin基因核苷酸序列系统发育树

将博乐地区（16、23）和塔城地区（1FTTacheng、4FTTacheng、4FHTacheng、21FHTacheng）测序获得的捻转血矛线虫β-tubulin 基因序列进行BLAST比对，选取不同捻转血矛线虫β-tubulin 基因序列（登录号分别为KX246658.1、KX246651.1、KX246666.1、KJ410522.1、KJ410523.1、KX246667.1、KX246668.1），同科、不同属的环纹背带线虫（登录号分别为KF483653.1、KF483647.1、KP204098.1、KP204100.1） 以及不同科、不同属的羊仰口线虫（登录号为KP792295.1），应用MEGA6.0软件构建进化树进行系统发育分析。结果表明，本试验所测捻转血矛线虫序列与GenBank上发表的相应捻转血矛线虫虫株序列聚为一支，置信度为100%，与捻转血矛线虫同科、不同属的环纹背带线虫虫株序列相聚类，置信度为100%，其外群为不同科、不同属的羊仰口线虫，登录号为KP792295.1，内群与外群分别形成独立的进化分支。

图3 捻转血矛线虫的遗传距离矩阵

用MEGA6.0软件计算的遗传距离矩阵显示：环纹背带线虫的种间距离为0～0.059，捻转血矛线虫为0～0.082，1FTTacheng为0.009～0.080，4FHTTacheng为0.05～0.061，4FHTacheng为0.021～0.080，16Bole为0.012～0.074，23Bole为0.033～0.065。本试验测定的捻转血矛线虫遗传距离均在捻转血矛线虫种间距离内，说明为同种，同时也说明毛圆科的β-tubulin基因种间遗传距离为0～0.082。

3.4 序列比较分析

将进化树中从GenBank上下载的捻转血矛线虫β-tubulin基因序列与本研究测定的序列进行排序比对，发现相似度为96.86%，有89个变异位点（图4），其中KJ410522.1与KJ410523.1，KX246658.1与KX246651.1的 G、A、T、C含量相同。本研究测定序列4FHTacheng的G和C含量低于其他捻转血矛线虫序列，其他测定序列在G、A、T、C含量上无明显差异（表2）。

从13种捻转血矛线虫β-tubulin基因序列碱基分布表中可看出，G基因碱基分布平均在21%左右，A基因在27%左右，T基因在30%左右，C基因在21%左右，说明碱基在长期进化过程中出现了颠倒转换、缺失、突变等变化。整体上看，G+C的含量小于A+T的含量，说明出现了碱基偏移。

3.5 抗药性分析

经多序列比对发现，与突变株相比，所采集的6个样品的第200位氨基酸残基密码子为TTC（苯丙氨酸），而突变株为TAC（酪氨酸），说明采集的这6个样品为敏感型（图5）。

4 讨论

图4 捻转血矛线虫β-tubulin基因序列比对结果

表2 13种捻转血矛线虫β-tubulin基因序列碱基分布%

图5 博乐地区、塔城地区及突变株β-tubulin基因多序列比对结果

捻转血矛线虫作为一种肠道寄生线虫广泛流行于世界各地。国内学者对全国各地捻转血矛线虫感染情况的调查结果显示，不同地区感染率差异较大，为12.5%～100%。我国新疆地区地域辽阔，牧草资源丰富，养羊业多采用散养放牧的养殖方式。与圈养相比，放牧环境下的羊接触污染草料和土地的概率明显增高，因此感染寄生虫的概率更高。本次试验结果显示，博乐地区共发现捻转血矛线虫55只，塔城地区发现27只，感染情况并不太高。这可能是因为本次流行病学调查采集样品的时间为6—7月，属于夏季。而捻转血矛线虫感染一般在春季和秋季较严重，这两个季节气候条件相对适宜，非常适合寄生虫生长繁殖，因而感染率相对较高。

近年来，基因分类学以及进化分析手段已应用于寄生虫生态学、流行病学以及进化相关研究中，为更好地掌握寄生虫进化特征提供了技术支持。特异性分子鉴定对于正确鉴别寄生虫种类、迁移及进化来说非常有效，而基因特征分析对更精确诊断寄生虫病以及制定更合理的防控措施十分重要。

β-tubulin基因是细胞内微管的基本结构单位。微管蛋白对于保持细胞形状、运动、胞内物质运输起到了不可或缺的作用。β-tubulin与毛圆科寄生线虫的治疗药物——苯并咪唑类药物（BZ）的药理作用发挥有关。药物选择性地与虫体细胞内的微管蛋白结合，通过干扰微管蛋白变化，影响微管和微管蛋白之间的自由集合，从而抑制虫体内微管的组装而发挥作用[9-10]。

本次试验将阳性样品筛选后进行测序，应用MEGA6.0软件构建进化树，进行系统发育分析，将测序结果在NCBI中用BLAST进行相似性检索，与GenBank登录号分别为KX246658.1（761 bp）、KX246651.1（760 bp）、KX246666.1（760 bp）、KJ410522.1（813 bp）、KJ410523.1（813 bp）、KX246667.1（767 bp）、KX246668.1（767 bp）的核苷酸相似性分别为94.13%、94.13%、95.68%、99.47%、99.74%、98.20%、97.79%。结果表明，所测捻转血矛线虫序列与GenBank上发表的相应捻转血矛线虫虫株序列聚为一支，置信度为100%，与捻转血矛线虫同科、不同属的环纹背带线虫虫株序列相聚类，置信度为100%，其外群为不同科、不同属的羊仰口线虫，登录号为KP792295.1，内群与外群分别形成独立的进化分支。

苯丙咪唑类药物是防治消化道线虫的主流药物之一，在我国使用年限长。在国外，已有较全面的报道，表明捻转血矛线虫已出现苯并咪唑类抗药性虫株。而国内，相关的报道却不多见。本次试验对选取的博乐和塔城地区捻转血矛线虫样品进行多序列比对发现，与抗性虫株序列相比，博乐和塔城地区样品的第200位氨基酸均未发现突变，说明选取的样品是对苯并咪唑类药物敏感的。

本研究有助于新疆开展线虫病的综合防控，也为制定更合理的线虫防控方案提供了参考，并为寄生虫系统进化分析研究奠定了基础。