我国不同地区鸡源致病性大肠杆菌分离株的PFGE分子分型

2020-04-04高玉斌王君玮颜世敢盖文艳

中国动物检疫 2020年4期

高玉斌，赵格，王君玮，邹明，颜世敢，盖文艳，王琳，王娟

（1.中国动物卫生与流行病学中心，农业农村部畜禽产品质量安全风险评估实验室（青岛），山东青岛 266032；2.青岛农业大学动物医学院，山东青岛 266109；3.齐鲁工业大学食品工程学院，山东济南 250353）

脉冲场凝胶电泳（pulse field gel electrophoresis，PFGE）以其重复性好、分辨力强而被誉为细菌分子生物学分型技术的“金标准”，被广泛应用于大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等多种菌属的分子流行病学研究[1-3]。其基本原理是将细菌包埋于琼脂块中，用适当的内切酶在原位对整个细菌染色体进行酶切，使酶切片段在特定的电泳系统中，通过电场方向的不断交替变换，在合适的脉冲时间条件下得到良好的分离。

近年来，通过PFGE细菌分型技术构建食源菌分子分型监测网络，进而实现对细菌感染引发疾病或食品安全突发事件的追踪溯源，已在多起公共卫生事件处置中发挥着重要作用。王文斟等[4]运用PFGE技术，对引起两所学校细菌性疾病的分离株进行分子分型，追溯传染来源发现，引起此次疫情的志贺氏流行菌株和环境株为同一来源菌株，由此判定疫情是因水源污染引发的。Kim等[5]调查2010—2012年韩国京畿道地区学校发生的由致病性大肠杆菌引起的食源性疾病暴发事故发现：98株致病性大肠杆菌分离株由EPEC（50%）、ETEC（34%）、EAEC（15%）和EHEC（1%）组成，通过PFGE分析将其分为9个簇和31个带型，相似度为57%，从人群中获得的EHEC菌株显示出几乎相同的PFGE带型，表明这些菌株之间的亲缘关系非常密切。

鸡源大肠杆菌不仅会引起鸡只腹泻、气囊炎、滑膜炎等疾病，而且可因继发感染导致生长缓慢、产蛋下降，严重影响养鸡业正常生产。有些血清型的鸡源大肠杆菌还能通过自身或分泌毒素污染鸡肉、鸡蛋等生鲜产品，进而带来食品安全隐患，威胁消费者身体健康[6]。本研究利用PFGE方法，对分离自山东、吉林、西藏、新疆等7个代表性地区的鸡源致病性大肠杆菌进行了分子分型，以期了解我国不同地区鸡源大肠杆菌的分子流行病学关联情况，以便指导禽大肠杆菌病的用药防控，并为未来可能的禽源食品安全事件溯源积累基础数据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

2017年从我国7 个省（自治区）病死鸡泄殖腔拭子样品中分离鉴定的大肠杆菌，共130株，其中吉林20株、山东28株、山西30株、西藏18株、新疆7株、江苏15株、云南12株，均由中国动物卫生与流行病学中心致病微生物监测室保存；大肠杆菌标准菌株（ATCC 25922），购自中国兽医药品监察所。

1.2 主要试剂

胰蛋白大豆胨肉汤，购自北京陆桥生物技术有限公司；乙二胺四乙酸（EDTA）、十二烷基硫酸钠（SDS）、三羟甲基氨基甲烷盐酸（Tris HCl），购自Sigma公司；PFGE 电泳级琼脂糖（Sea Kem Gold Agarose），购自美国 BIO-RAD公司；蛋白酶K、限制内切酶XbaI，购自青岛擎科梓熙生物技术有限公司；细胞悬浮液、TE缓冲液、0.5×TBE电泳缓冲液、XbaI酶切缓冲液等，由实验室按照常规方法配制。

1.3 主要仪器

CHEF MAPPER II脉冲场电泳仪，美国Bio-Rad公司；全自动凝胶成像系统，美国BIO-RAD公司；生物安全柜，美国Labconco公司；超纯水机Milli-Q Synthesis，德国millipore公司；紫外分光光度计，上海精密仪器仪表有限公司；恒温培养箱，太仓市实验设备厂。

2 方法

2.1 试剂配制

（1）TBS缓冲液（pH7.5）：100 mmol/L Tris-HCl、300 mmol/L NaCl；

（2）细胞悬浮液（CSB）：取5 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）和10 mL 0.5 mol/L EDTA（pH8.0）于容量瓶中，用灭菌纯水稀释到50 mL，灭菌备用；

（3）细胞裂解液（CLB）：取10 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）和20 mL 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）混匀后加入2 g Sarcosyl纯水稀释到200 mL，灭菌备用；

（4）TE 缓冲液：取20 mL 已配好的1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）和4 mL 0.5 mol/L EDTA（pH8.0）于容量瓶中，用灭菌纯水精确稀释到2 000 mL，灭菌备用；

（5）0.5×TBE电泳缓冲液：220 mL 5×TBE用纯水精确稀释到2 200 mL。

2.2 试验步骤

参照美国疾病控制和防护中心（CDC）-Pulse Net 中用于大肠杆菌的PFGE标准方法[7]，对部分环节稍作修改。

2.2.1 菌株培养将-80 ℃冻存的大肠杆菌菌株，分别在大豆胨平板上培养出新的菌落，37 ℃培养16～20 h。

2.2.2 胶块制备用比浊仪调整菌液浓度，使其OD值介于4.0～4.5；制备好脉冲场电泳级琼脂糖，加入配置好的SDS放于60 ℃水浴箱中保存备用；取20 μL蛋白酶K加入到相应的1.5 mL离心管中，然后加入400 μL调制好的菌液，混匀；再加入400 μL配置好的胶溶液，混匀，然后加入制胶模具。胶块制作过程中，应注意避免气泡产生。

2.2.3 细胞裂解每个离心管中加入5 mL细菌裂解液（CLB），再分别加入25 μL蛋白酶K；将制成的小胶块放入对应的50 mL离心管中，需保证胶块在液面下；将离心管放在54 ℃，130 r/min水浴摇床中孵育2 h；将无菌纯水和配制好的TE溶液放在50 ℃恒温水浴箱中预热。

2.2.4 胶块清洗裂解完成后，先用预热纯水清洗后，放于50 ℃水浴摇床中振摇10 min；再加入预热的TE溶液，然后放回50 ℃的水浴摇床中振摇15 min，重复3次；将胶块转移到2 mL离心管中，加入TE溶液，4 ℃保存备用。

2.2.5 胶块内DNA酶切配制的缓冲液体系为：160 μL超纯水、20 μL BSA、20 μL 10×M。每管加入200 μL缓冲液，切胶；将装有缓冲液和切好胶块的离心管，放在37 ℃水浴箱中孵育15 min，然后进行酶切。酶切体系为：2 200 μL超纯水、280 μL BSA、280 μL 10×M、40 μLXBaI酶。吸出缓冲溶液，加入配好的酶切体系200 μL，在水浴锅中37 ℃酶切2～3 h。

2.2.6 加样将1.5 g电泳级琼脂糖加入装有150 mL TBE的螺口瓶中，在微波炉内加热至透明，然后放54 ℃水浴锅15～30 min；组装好制备胶块模具，使梳子齿保持在同一水平面上；从水浴箱中取出酶切好的胶块，放至室温平衡5 min；弃去酶切混合液，再加入200 μL 0.5×TBE缓冲液清洗3 min，制备胶块。

2.2.7 电泳加入2.1 L 0.5×TBE，将泵设在-70（这时缓冲液的流速约1 L/min）；打开冷凝机，确保预设温度在14 ℃。设置脉冲场电泳参数：夹角120°、脉冲时间2.2～54 s、电泳时间20 h。

2.2.8 图像的获取将胶块放在盛EB溶液的托盘内（EB储存液浓度为10 mg/mL，1:10 000稀释），并放在摇床上25～30 min；在托盘中加入400 mL纯水，放在摇床上脱色90 min，拍摄图像。

2.2.9 PFGE聚类分析将PFGE图像导入BioNumerics软件包进行处理，选择Dice相关系数和UPGMA方法，tolerance设置为1.5%。

3 结果

3.1 大肠杆菌酶切

根据美国疾病控制和防护中心（CDC））Pulse Net 对大肠杆菌的脉冲场电泳使用建议，用限制性内切酶对非O157大肠杆菌进行酶切。PFGE的酶切图谱如图1所示：条带越相似，说明菌株亲缘关系越近，例如4号和6号，7号和11号。

图1 大肠杆菌PFGE酶切图谱

3.2 PFGE聚类分析

将130株大肠杆菌脉冲场电泳产生的图谱，用Gel Documentation 2000软件（Bio-Rad，USA），将凝胶图像转换为Tiff文件，然后使用BioNumerics软件进行分析（Applied Maths 比利时），并绘制分离菌株的相关性树状图（图2）。

图2 部分大肠杆菌的PFGE图谱树状图

130株大肠杆菌菌株具有各自的PFGE图谱，其中SX10、SX9和SX8图谱相似度为100%，SX13和SX14相似度为100%，说明山西分离株存在较多的同源菌株。另外，JLJ2和JLJ12图谱相似度为100%，表明JLJ2和JLJ12是同源克隆菌株，但新疆菌株整体来看分布在不同的簇。除山西和新疆外，吉林也存在两株同源菌株，但这两株分离菌与吉林其他分离菌的亲缘关系却很远。

不同地区的菌株亲缘关系很远，只有江苏JS8和吉林JLX5、云南YN18和新疆XJ1亲缘关系相对较近，但仅为80%，其他不同地区菌株的亲缘关系都介于45%～80%。有33株菌株的图谱相似度在90%以上。130株大肠杆菌分离株共分为105个PFGE类型，其中山西菌株10个、山东28个、江苏15个、吉林17个、西藏18个、新疆5个、云南12个，表明同一地区分离的菌株可能来自同一克隆，不同地区间存在菌株水平传播的可能。从菌株来源分析，不同地区菌株PFGE图谱的带型差别较明显，即使是相同地区的菌株，其PFGE带型差异也较大，显示了分离株中的菌株遗传多样性。

4 讨论

PFGE的结果是菌株DNA电泳图谱，通常采用分子分型软件（Bio Numerics）来分析菌株之间的同源相关性，分析结果通常以百分数方式表示。百分数越小，表示菌株间的亲缘关系越远；百分数越大，表示菌株间的亲缘关系越近。Tenover等[8]认为，如果两个菌株之间有 0～3条不相同条带，则认为两株菌为同源克隆菌株；如果有4～6条不相同条带，则只能认为两株菌亲缘关系较近；两者之间若有7条以上不相同条带，那么就认为两株菌是非同源关系。但是这种判断标准有一定的局限性，仅适合对一些基因变化量少的进行研究。由于细菌经常会产生某些基因方面的变异，因此在分析解释PFGE结果，判断菌株是否有遗传相关性时，要考虑此差异的出现。此后，Talon等[9]提出只要有85%以上相同条带，则可认为是相同菌株，有50%以上不同条带，则认为菌株不相关。

PFGE允许在分离株之间进行更精细的比较，并证实这些分离菌株与其他分离株之间的遗传相关性。XbaI-PFGE分析结果显示出分离菌具有高度的遗传多态性，表明系统分离中菌株存在多样性，树状图还强调了7个地区的鸡源菌株存在相似的菌株类型。

本研究发现，大肠杆菌PFGE基因型存在轻微变异，总体相似度值约为60%～100%。Dai等[10]研究了16株来自不同农场的多抗鸡源大肠杆菌PFGE分类分析，发现有16种不同的带型，充分体现了大肠杆菌的多态性分布，表明在分离株的水平分布和垂直传播之间存在遗传规律。因此，结合PFGE分类方法，有助于找到细菌分子特征的流行优势，确定菌株的区域特征。Ozaki等[11]为了调查肉鸡大肠杆菌的流行病学遗传和细菌学特征，从4个商业农场肉鸡的心包炎和肝周炎病变中获得了92株大肠杆菌，使用脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术，将92个分离菌株分类为33种脉冲型；从不同采样时间的多个农场的肉鸡中获得的分离株中观察到相同的脉冲型，具有相同脉冲型的分离株表现出毒力因子和系统发育组的相关性；具有相同毒力因子的大肠杆菌菌株会引起大肠杆菌病的发生，并可以在多个农场中的大肠杆菌菌株之间传播。Ferreira[12]等对分离自家禽泄殖腔的200株大肠杆菌，用PFGE技术进行分型，发现了18种不同的PFGE类型。所有的E.fergusonii分离株均显示相同的PFGE类型，两种Klebsiella oxytoca分属于不同的PFGE类型，在携带PMQR基因的大肠杆菌中发现了系统发育组A、B1和D，基于系统发育分析和PFGE，发现即使在同一农场内，大肠杆菌分离株的种群结构也是多样的。