NF-κBIA基因多态性与新生儿细菌性脑膜炎易感性相关性分析

李文娟 梅家平 杨勇

[摘要] 目的 探究NF-κBIA基因多态性与新生儿细菌性脑膜炎易感性的关系。 方法 选取2016年3月～2019年3月南方医科大学附属深圳妇幼保健院新生儿科收治的新生儿211例，其中新生儿脑膜炎患者67例为病例组，正常新生儿69名为对照组，非脑膜炎炎性发热新生儿75例为发热组。采用Sanger法测序，通过PCR扩增，对NF-κBIA基因的2个SNP位点（rs3138053、rs2233406）进行基因分型。观察NF-κBIA基因多态性与新生儿细菌性脑膜炎的易感相关性。 结果 三组新生儿rs3138053、rs2233406位点的期望值和观察值吻合度良好，均符合哈迪温伯格平衡（P > 0.05）。rs3138053位点的基因型频率与新生儿细菌型脑膜炎易感性存在相关性（P < 0.05）。 结论 NF-κBIA基因多态性与新生儿细菌性脑膜炎易感性相关。

[关键词] 新生儿细菌性脑膜炎;NF-κBIA基因;单核苷酸多态性;基因型

[中图分类号] R742.6          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）02（c）-0019-04

[Abstract] Objective To investigate the relationship between NF-κBIA gene polymorphism and neonatal bacterial meningitis susceptibility. Methods From March 2016 to March 2019， 211 cases admitted to the Department of Neonatology， Affiliated Shenzhen Maternity & Child Healthcare Hospital， Southern Medical University. Among them， 67 cases of neonatal meningitis were in the case group， 69 normal neonates were in the control group， and 75 cases with non-meningitis inflammatory febrile neonates were in the fever group. Two SNP sites （rs3138053 and rs2233406） of NF-κBIA gene were genotyped by PCR amplification using Sanger sequencing. The genotype sequencing results of different sites and the susceptibility analysis of neonates bacterial meningitis were observed. Results rs3138053 and rs2233406 were in good agreement with the expected value and the observed value in three groups， which were consistent with Hardy-Weinberg equilibrium （P > 0.05）. rs3138053 was correlated with the susceptibility of neonatal bacterial meningitis （P < 0.05）. Conclusion NF-κBIA gene polymorphism is associated with susceptibility to neonatal bacterial meningitis.

[Key words] Neonatal bacterial meningitis; NF-κBIA gene; Single nucleotide polymorphism; Genotype

新生兒脑膜炎是一种以感染引起的脑膜炎症为特征的疾病，通常发生在生命的前28 d。新生儿细菌性脑膜炎（neonatal bacterial meningitis，NBM）的发病率为（0.25～1）/1000活产婴儿，其中大约25%的新生儿患有菌血症[1]，其病死率和后遗症发生率高[2]。核因子-κB（NF-κB）是新近研究发现的一组经典炎症信号通路中与炎性反应相关的基因，研究发现NF-κB基因的表达与细菌性脑膜炎的发生关系密切， 由NF-κBIA编码的IkBa是NF-κB活性的重要抑制剂[3-4]。单核苷酸多态性（SNP）是人类遗传学变异中最常见的一种。目前尚没有NF-κBIA基因多态性与新生儿细菌性脑膜炎相关研究，本研究旨在探讨新生儿NF-κBIA基因多态性与新生儿细菌性脑膜炎易感性的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

采用病例-对照研究方法，收集2016年3月～2019年3月南方医科大学附属深圳妇幼保健院（以下简称“我院”）新生儿科住院的足月新生儿，其中脑膜炎新生儿67例为病例组，正常新生儿69名为对照组，非脑膜炎炎性发热[5]新生儿75例为发热组。对照组，男27例，女42例;孕龄37～41周，平均（39.1±1.2）周;出生体重2900～3900 g，平均（3333.2±437.9）g。发热组，男32例，女43例;孕龄37～41周，平均（38.8±1.6）周;出生体重2900～3900 g，平均（3324.3±547.1）g。病例组男26例，女41例;孕龄37～41周，平均（38.7±1.6）周;出生体重2900～3900 g，平均（3243.5±678.1）g。三组一般资料比较，差异无统计学差异（P > 0.05），具有可比性。本研究经我院医学伦理委员会批准，参与研究患儿家属均签署知情同意。

纳入标准：符合第5版《实用新生儿学》[6]新生儿细菌性脑膜炎的诊断标准，患儿纳入病例组。因“发热”入院，经检查为细菌性炎症但非脑膜炎的患儿纳入发热组。因各种原因（包括家长因素）入院，经临床及实验室检查无病理情况的患儿纳入正常组。排除标准：①新生儿窒息或缺血缺氧性脑病等神经系统疾病;②遗传代谢性疾病者;③免疫缺陷病者;④内分泌系统疾病者;⑤先天性心脏病。

1.2 方法

1.2.1 标本采集及模板DNA提取  采取受试者静脉血1 mL，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，全血基因组DNA提取试剂盒[上海生工生物科技有限公司（以下简称“生工生物”），批号：B518253]抽提DNA。

1.2.2 SNP位点的选取  根据NCBI网站Genebank数据库已公布的NF-κBIA基因序列，选取2个已知炎症相关的SNP位点即rs3138053、rs2233406。

1.2.3 引物设计与合成  采用primer 5.0软件结合文献进行引物设计。聚合酶链式反应（PCR）引物设计完成后，交由生工生物合成引物。PCR引物及扩增片段长度见表1。

表1   PCR引物及扩增片段长度

1.2.4 PCR  以cDNA为模板，使用荧光定量试剂盒（美国ABCAM公司，批号：ab460332）进行实时荧光定量PCR反应;PCR产物纯化回收试剂盒（生工生物，批号：B518141）回收PCR产物。构成20 μL标准反应体系，特定条件下上机电泳，result group中寻找结果，并用sequence analysis软件进行分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件及Haploview 4.2软件进行数据分析，基因型频率采用基因计数法计算，等位基因频率分布用百分率（%）表示，组间频率比较采用χ2检验;以P < 0.05为差异有统计学意义。利用哈迪-温伯格遗传平衡定律检验病例组、发热组及对照组是否具有群体代表性，P > 0.05为基因型频的总体分布符合平衡定律。

2 结果

2.1 DNA提取及NF-κBIA基因引物电泳结果

结果显示DNA完整无降解，见图1。NF-κBIA基因的2个SNP位点表达显著，见图2。

2.2 基因型测序结果

rs3138053位点基因型测序结果为AG、AA、GG;rs2233406位点基因型测序结果为CT、CC、TT。见图3～4。

2.3 哈迪-温伯格平衡检验结果

2个SNP位点在病例组、发热组及对照组中的观察值和期望值吻合度良好，均符合哈迪-温伯格平衡定律（P > 0.05）。见表2。

2.4 基因型頻率分布比较结果

rs3138053位点中三组基因型频率比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。rs2233406位点中三组基因型比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表3。

3 讨论

新生儿细菌性脑膜炎发病率日益升高，是导致新生儿出现后遗症或死亡的主要疾病之一[7]。NF-κB定位于染色体4q24区域，NF-κB1基因是一种编码了105 kD大小的蛋白，参与调节机体炎性反应、免疫应答、氧化应激以及细胞凋亡等多种生理和病理过程[8-10]。

NF-κB通路的激活是细菌性脑膜炎发生的重要特征之一，其在介导大肠杆菌K1菌株（E. coli K1）侵袭人脑微血管内皮细胞及多核中性粒细胞迁移穿过血脑屏障中发挥了重要作用[11-12]，NF-κB信号通路激活，促进中性粒细胞中MRP8/14的释放，增强肺炎球菌性脑膜炎小鼠炎性反应[13]。在细菌性脑膜炎小鼠模型中，携带NF-κB1 ATTG1/ATTG1多态性位点的小鼠，其神经炎症和神经细胞凋亡减少[14]，并藉此抑制E. coli K1的侵袭和中性粒细胞迁移。NF-κB调节实验性肺炎链球菌脑膜炎中的脑源性神经营养因子（BDNF），可能为肺炎链球菌脑膜炎提供潜在的治疗靶点[15]。Western blot结果显示，细菌性脑膜炎患者集落刺激因子NF-κB基因多态性SNP位点rs2233406活性高于无菌性脑膜炎患者，在癌性脑膜炎中几乎不被激活[16]。脑膜炎患者脑脊液（CSF）细胞中NF-κB活化倾向于与白细胞介素-6浓度相关[17-19]。NF-κB基因及其单核苷酸多态性位点的携带在细菌性脑膜炎疾病发生及演变中发挥重要作用。近年来研究显示[20-24]，NF-κBIA基因包含多个SNP位点，如-881 A/G（rs3138053）、-826 C>T（rs2233406）、-297 C/T（rs2233409）、3′UTR A>G（rs696），其差别多态性基因与类风湿性关节炎病、溃疡性结肠炎、炎症性肠病、多发性硬化症、帕金森病、以及1型糖尿病等许多慢性炎症性疾病易感性相关。本研究结果显示，NF-κBIA基因SNP位点rs3138053与新生儿细菌性脑膜炎发病相关，结果与Baldwin等[25]研究一致。rs2233406（C/C）在病例组中出现的频率高于对照组，提示患儿与健康新生儿可能存在基因多态性的表达差异。

综上所述，NF-κBIA基因多态性对新生儿细菌性脑膜炎可能存在较强相关性，对了解新生儿脑膜炎的发生及疑似患儿的筛检等方面有积极意义。因此，在探究NF-κBIA基因多态性与新生儿细菌型脑膜炎的相关性时，严格设计、进一步选择多中心的大样本，检测覆盖更多不同基因区域的SNP是非常必要的。希望这种遗传异质性的揭示，为研究新生儿细菌性脑膜炎与基因多态性提供新的遗传线索。

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（收稿日期：2019-06-17  本文編辑：刘明玉）