心脏收缩力调节对慢性心力衰竭兔心室肌电重构的影响*

张飞飞， 赵士霞， 郝清卿， 李 榕， 李英肖， 党 懿， 齐晓勇

(河北省人民医院， 河北 石家庄 050051)

慢性心力衰竭(chronic heart failure, CHF)是各种心脏疾病的晚期阶段，其患病率呈不断升高趋势，且具有较高的死亡率，死亡原因通常为恶性室性心律失常。慢性心力衰竭合并恶性心律失常的机制与心室肌电重构密切相关，包括心肌细胞膜离子通道改变及细胞间缝隙连接的重构[1]。心脏收缩力调节(cardiac contractility modulation, CCM)是在心肌组织绝对不应期内给予的高强度电刺激，可通过调节细胞外基质代谢，影响心肌细胞结构蛋白、钙转运蛋白及胚胎基因蛋白的表达，增强心肌收缩力，改善心室结构重构，从而改善心脏功能[2]。心脏收缩力调节是一种新兴的非药物治疗心衰技术，其对于心室肌电重构的影响仍需进一步研究。本项工作应用升主动脉缩窄法建立兔慢性心力衰竭模型，测定心室电生理指标及Kv1.4，Kv4.3及缝隙连接蛋白43(connexin 43, Cx43)的表达水平，探讨心脏收缩力调节对于该模型心室肌电生理重构的影响。

材 料 和 方 法

1 实验动物和材料

选用6月龄新西兰大白兔30只作为实验对象，体重2.5～3.5 kg，雌雄不限，由河北医科大学动物实验中心提供，均于河北省人民医院临研中心动物房饲养。采用MICROPACE EPS320心脏电生理刺激仪给予心脏收缩力调节；小儿用临时起搏电极购自美敦力；应用FX-4010型12道自动分析心电图机记录体表心电图；应用Philips IU22彩色超声诊断仪(探头为S4-2，MHz)测定心脏超声各指标；抗Kv1.4、Kv4.3、Cx43和内参照β-actin抗体均购自河北博海生物工程开发有限公司；生物素标记的山羊抗兔IgGⅡ抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

2 主要方法

2.1慢性心力衰竭动物模型的建立 3%戊巴比妥钠溶液以1 mL/kg经兔耳缘静脉注射麻醉后，将兔仰卧位固定于动物手术台上，备皮，于胸骨左缘2、3、4肋间区，打开胸腔，暴露心脏，于升主动脉根部远端1.0 cm处游离升主动脉根部约4～5 mm，环扎升主动脉使其为原周长60%。术中将小儿用临时起搏电极弯针端缝合于心外膜左室前壁，直针端通过皮下穿刺固定于颈部，关闭胸腔。术后常规给予青霉素1.6×106U肌肉注射3 d预防感染。术后12周动物出现食欲下降、精神差、呼吸急促等心衰症状同时行心脏超声示左室射血分数≤40%视为模型制作成功。

2.2实验分组 实验动物随机分为3组：假手术(sham)组仅开胸和固定电极；心衰(heart failure,HF)组开胸、环扎升主动脉、固定电极；HF+CCM组开胸、环扎升主动脉、固定电极，并于术后12周模型制作成功后给予4周CCM刺激。

2.3CCM刺激 暴露动物模型颈部电极直针端，通过体表心电图R波触发EPS320刺激仪发放CCM刺激，脉宽2 ms，电压7 V，于R波感知后延迟30 ms发放，每天刺激6 h，连续刺激4周。

2.4电生理指标测定 记录兔十二导联心电图，以Q波的起始点至T波终点测定QT间期，连续测定3个心动周期取平均值。测定不同导联最长QT间期(QTmax)及最短QT间期(QTmin)，依据Bazett公式计算心率校正后的QT间期(QTc)，即QTc=QT/(R-R)1/2；采用电生理刺激仪以S1S2 程序递减刺激法，以起搏阈值2倍为输出电压，测定250 ms基础周长时的心室有效不应期(ventricular effective refrective period, VERP)，用S1S2间期递减扫描，S1S2呈8∶1，步长10 ms，当S2不能引起心室激动时, 将此S2值增加10 ms，再次进行S1S2间期递减扫描,步长2 ms,以S2激动心室的最长S1S2间期为VERP，重复测量3次。

2.5心室肌组织Kv1.4、Kv4.3和Cx43 mRNA水平的测定 使用TRIzol(Invitrogen)试剂提取心室肌标本的总RNA，取5 μL RNA用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，取1 μg总NRA参照TIANScript RT KIT试剂盒说明逆转录成cDNA，反应条件为：70 ℃ 5 min，25 ℃ 10 min，42 ℃ 50 min，95 ℃ 5 min。PCR引物由博海生物工程开发有限公司合成，具体引物序列见表1。将获得的cDNA按照实时荧光定量PCR试剂盒说明书扩增目的基因,PCR热循环参数为：95 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。以GAPDH为内参照。反应结束后确认扩增曲线和熔解曲线。应用荧光定量PCR仪，采用2-ΔΔCt方法计算各目的基因的相对定量 (relative quantification, RQ)值,将RQ值用于统计分析。

2.6心室肌组织Kv1.4、Kv4.3和Cx43蛋白表达的测定 取100 mg心室肌组织标本，剪碎、离心，用BCA法测定蛋白浓度，经非连续梯度SDS-PAGE分离蛋白，将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜上置于封闭液中，室温温育1 h，再加入Ⅰ抗，4 ℃摇床上过夜，应用洗液漂洗，再加入Ⅱ抗，室温摇床上孵育1 h，然后用洗液漂洗。最后将显色剂加入PVDF膜上，1 min后放入暗室曝光。定影后采用UVP分析仪器，对胶片进行扫描，系统自动生成每一个条带灰度值。

表1 RT-qPCR的引物序列

3 统计学处理

运用SPSS 16.0统计软件分析处理数据。计量资料均采用均数±标准差(mean±SD)表示，组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 动物一般情况

30只新西兰大白兔中，假手术组实验动物全部存活，心衰组术中因分离环扎升主动脉过程中损伤分支动脉出现大出血死亡1只，心衰+CCM组中因开胸过程中损伤胸廓内动脉发生大出血死亡1只。心衰组及心衰+CCM组中各存活9只且均满足心衰标准。

2 电生理指标结果

实验第12周末，与假手术组相比，心衰组和心衰+CCM组QTc显著延长(P<0.05)；实验第16周末，与心衰组相比，心衰+CCM组经4周CCM刺激后QTc缩短(P<0.05)。实验第16周末，与假手术组相比，心衰组和心衰+CCM组VERP显著延长(P<0.05)；与心衰组相比，CCM显著缩短心衰模型免VERP(P<0.05)。见表2。

表2 CCM对慢性心力衰竭兔QTc及VERP的影响

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsHF group.

3 心室肌组织Kv1.4、Kv4.3和Cx43 mRNA的表达

与假手术组相比，心衰组心肌组织中Kv1.4、Kv4.3和Cx43 mRNA水平显著下降(P<0.05);与心衰组相比，CCM上调心衰兔心肌组织中Kv1.4、Kv4.3和Cx43 mRNA的水平(P<0.05),见图1。

Figure 1.The mRNA levels of Kv1.4, Kv4.3 and Cx43 in ventricular myocardium. Mean±SD.*P<0.05vssham group;#P<0.05 HF group.

图1 各组心室肌组织中Kv1.4、Kv4.3和Cx43的mRNA水平

4 心室肌组织Kv1.4、Kv4.3和Cx43蛋白的表达

与假手术组相比，心衰组心肌组织中Kv1.4、Kv4.3和Cx43 的蛋白表达显著下降(P<0.05);与心衰组相比，CCM上调心衰兔心肌组织中Kv1.4、Kv4.3和Cx43蛋白的表达水平(P<0.05),见图2。

讨 论

慢性心力衰竭是心肌组织对多种致病因素失代偿而出现的心脏结构和(或)功能异常的临床综合征，易并发恶性室性心律失常，是导致死亡的主要原因。慢性心力衰竭时恶性室性心律失常发生的根本机制为心室肌电重构，包括细胞膜离子通道和细胞间缝隙连接蛋白的改变，从而导致心室肌细胞复极延迟，动作电位时程延长及心室肌细胞间电传导延迟或不均一性，最终出现心室肌复极离散度增加[3]。基于压力负荷增加是慢性心力衰竭发生的重要原因，且新西兰兔心室肌组织与人类心室肌组织具有相似的离子通道及缝隙连接蛋白表达，本研究应用升主动脉缩窄法建立慢性心力衰竭兔模型，模拟人类慢性心力衰竭时心室肌电生理重构[4]。QTc反映全部心室肌细胞除极和复极过程的总时程，与心肌细胞电活动及室内传导等相关，QTc增大提示心室肌细胞异常激动、室内传导延迟，可用于评价心肌电活动状态及恶性心律失常发生的风险[5-7]。本研究通过升主动脉缩窄法成功建立慢性心力衰竭动物模型，显示实验组中QTc较假手术组QTc明显延长，提示存在心肌电重构，其心律失常易感性增加。

Figure 2.The protein expression of Kv1.4, Kv4.3 and Cx43 in ventricular myocardium. Mean±SD.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsHF group.

图2 各组心室肌组织中Kv1.4、Kv4.3和Cx43的蛋白表达

瞬时外向钾电流(transient outward potassium current，Ito)是心室肌细胞复极中的主要外向电流，形成心室肌细胞动作电位l期。Kv4.3和Kv1.4是Ito通道α亚单位的重要编码基因[8]。既往研究证实慢性心力衰竭时心室肌细胞Kv4.3和Kv1.4表达水平下降，Ito密度下降，心室肌细胞动作电位时程和VERP延长。此外Kv4.3和Kv1.4尚可通过影响L型钙通道、钠钙交换体的活性状态，调节兴奋收缩偶联过程、心肌收缩性及参与心肌细胞整个复极过程[9-10]。本研究结果与既往的研究相似，心衰兔心室肌组织Kv4.3和Kv1.4表达水平下降，VERP明显延长。

缝隙连接蛋白广泛参与心肌细胞间电、化学信号通路传导。缝隙连接介导的心电冲动是维持正常心电功能的重要保障，Cx43为心室肌细胞的主要连接蛋白，相邻心肌细胞之间的电耦联即由Cx43所组成的缝隙连接通道主导[11]。Cx43的异常表达可参与房性及室性心律失常的发生及维持[12-13]，后续有基础研究表明慢性心力衰竭的心室肌组织可出现Cx43的表达数量、分布方式和功能发生改变，即缝隙连接重构，对心室肌电重构产生了明显影响[14]。本研究结果与既往研究的相似，心衰兔心室肌组织Cx43表达水平下降。Cx43表达下降不仅影响心室肌细胞的传导性，且在Cx43表达较低的区域心肌组织跨壁离散度增大，导致心室肌不同部位的传导时间和复极时间离散度增加，这与恶性室性心律失常和心源性猝死发生密切相关。

心脏收缩力调节为新兴的非药物治疗心衰方法。Sabbah等[15]首次报道CCM动物实验结果，2001年Pappone等[16]率先将其应用于人体研究。目前研究证实CCM可通过调节肌浆网钙ATP酶、钠钙交换蛋白-1、受磷蛋白、雷尼丁受体、细胞骨架蛋白、基质金属蛋白、P38丝裂原激活蛋白激酶等的表达或磷酸化水平，增强心肌收缩力，改善心肌重构[17]。国内亦有研究应用膜片钳技术证实CCM可影响豚鼠心肌细胞膜钠钙交换电流和L型钙通道电流[18]。2016 ESC急慢性心力衰竭诊断与治疗指南中推荐在选择性心衰患者可应用CCM治疗[19]。CCM对于心衰心肌电生理重构的影响较少报道，Winter等[20]指出CCM可增加健康兔离体乳头肌细胞Iks电流，缩短动作电位时程，有可能出现增加心律失常风险，但后续临床研究报道CCM可降低慢性心力衰竭患者死亡率，可能部分获益与减少恶性室性心律失常的发作[21]。课题组前期研究发现CCM可通过TGFβ信号通路改善慢性心力衰竭兔心肌结构重构，且研究表明心衰兔心肌组织心电重构与结构重构密切关联[22]。

综上所述，本研究结果显示慢性心力衰竭兔心室肌Kv1.4、Kv4.3和Cx43的表达下降可能是其电重构的机制，心脏收缩力调节可能调节以上基因的表达，缩短心室肌有效不应期，降低QTc离散度，改善慢性心力衰竭兔心室肌电重构，为心脏收缩力调节的临床应用提供了实验基础。后续仍需进一步应用膜片钳技术检测离子通道功能学上的变化。