组蛋白H3K36me3与缺血再灌注诱导小鼠急性肾损伤的相关性研究*

2020-04-03徐卫卫伍聪聪王笑笑简久莹杨又璇刘丽荣

中国病理生理杂志 2020年3期

徐卫卫，伍聪聪，王笑笑，简久莹，杨又璇，张妮，郭兵，刘丽荣△

(1贵州医科大学医学检验学院临床血液学教研室，贵州贵阳 550004； 2贵阳市第一人民医院输血科， 3贵州医科大学贵州省常见慢性疾病发病机制及药物研究重点实验室，贵州贵阳 550025)

急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是临床上危重症常见的严重并发症，发生率和死亡率均较高，并有逐年增高趋势[1-2]。AKI由多种病因造成，其中缺血再灌注(ischemia/reperfusion，IR)引起AKI是临床上最常见的发病原因之一[3]。尽管经过多年研究，目前对IR引起的AKI仍缺乏有效的预防和治疗措施。因此，进一步研究IR诱导AKI的发病机制及有效的治疗措施至关重要。

据文献报道，表观遗传学参与了肾脏疾病的发生与发展过程，在基因转录调控中起重要作用[4-5]。组蛋白甲基化是目前研究较广泛深入的表观遗传修饰方式之一，是指组蛋白在组蛋白甲基转移酶的作用下发生甲基化修饰的过程，通过影响组蛋白与DNA的亲和性来改变染色体空间结构及状态，调控基因的表达[6]。组蛋白不同位点的甲基化由不同的甲基转移酶催化完成[7],如组蛋白H3第36位赖氨酸(histone H3 lysine 36，H3K36)可由N-赖氨酸甲基转移酶SMYD2(SET and MYND domain containing 2)催化发生三甲基化(H3K36me3)。在常染色体显性多囊肾患者和小鼠的肾上皮细胞中，SMYD2催化组蛋白H3K36和多种信号蛋白甲基化参与了肾囊肿生成和细胞凋亡[8]。组蛋白甲基转移酶Set2介导的H3K36me3在DNA双链断裂(DNA double-strand break，DSB)处富集，促进DSB修复,减轻组织或细胞损伤[9],但H3K36me3是否参与AKI的发生与发展目前尚无相关文献报道。研究发现，多种表观遗传修饰参与了AKI的发生与发展[10]，故本研究通过观察H3K36me3在IR诱导的AKI小鼠肾组织中的表达变化，分析其与肾组织SMYD2及肾损伤程度的相关性，旨在探讨H3K36me3在IR-AKI中的作用及其可能机制。

材料和方法

1 材料

1.1实验动物健康雄性ICR小鼠，体重18～20 g，周龄8周，购买于斯贝福(北京)生物技术有限公司，许可证号为SCXK(京)2016-0002，适应性喂养1周，自由饮水、摄食。

1.2主要器械、仪器及试剂双垂直电泳仪(北京六一，DYCZ-24DN)；全波长酶标仪(BIO-RAD，V111584)；高速离心机(BECKMAN Allegra X-30R Centrifuge)；自动生化分析仪(Cobas, c702)；旋涡振荡器(杭州米欧，MIX-28+)；光学显微镜(耐博，M-30D)。蛋白提取试剂盒(Solarbio，R0010)；BCA定量试剂盒(碧云天，P0010S)；免疫组化试剂盒(Bioss，SP-0023)；DAB显色试剂盒(Bioss；C02-04001)。抗体：β-actin(Bioss，bs-0061R)；中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL；Boster，PB0641)；H3K36me3(Abcam，ab9050)；P53(Wanleibio，WL01919)；p-P53(Wanleibio，WL02504)；促凋亡因子Bax(Wanleibio，WL01637)；抗凋亡因子Bcl-2(Wanleibio，WL01556)；cleaved caspase-3(Santa，sc7272)；信号转导和转录活化因子3(signal transducer and activator of transcripition 3，STAT3;Abcam，ab68153)；p-STAT3(Abcam，ab76315);c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK;Abcam，ab179461);p-JNK1/2/3 (Abcam，ab124956)。

2 方法

2.1IR诱导AKI小鼠模型的构建将30只ICR小鼠随机分为IR组和假手术(sham)组。术前禁食8 h，自由饮水。腹腔注射戊巴比妥钠(65 mg/kg)麻醉，固定、备皮、消毒，沿腹中线左右各0.5 cm分别作纵行切口，暴露双侧肾脏钝性剥离肾蒂。微动脉夹夹闭双侧肾蒂，1 min内可见肾脏由鲜红色变为紫黑色。夹闭45 min后，松开微动脉夹恢复血流灌注，观察肾脏颜色变为鲜红色，缝合腹腔。sham组仅钝性剥离肾蒂，其余与IR组做相同处理。

2.2标本收集小鼠给予标准饲料喂养，自由饮水摄食24 h。乙醚麻醉后眼眦取血，分离血清检测肾功能指标。开腹留取双侧肾脏，1/2肾脏置于4%多聚甲醛中固定，用于肾组织病理分析；其余1/2肾脏置于-80 ℃冰箱中储存，用于提取总蛋白和后续检测。

2.3生化方法检测肾功能指标血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和血清肌酐(serum creatinine，SCr) 将全血置于低速离心机4 000 r/min离心5 min，取上清，应用Cobas 702全自动生化分析仪检测各组小鼠BUN和Scr含量。

2.4HE染色观察肾组织病理学的改变采用4%多聚甲醛固定肾组织，脱水浸蜡，石蜡包埋，制成3 μm厚的石蜡切片，脱蜡透明后行HE染色，光学显微镜下观察肾组织形态结构。

2.5免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)染色检测肾组织中NGAL和cleaved caspase-3的变化石蜡切片，常规脱蜡至水，高压抗原修复，3% H2O2灭活组织内源性过氧化物酶20 min，正常山羊血清工作液封闭30 min，孵育 I 抗4 ℃过夜，室温复温30 min，室温孵育 II 抗30 min，DAB显色，显微镜观察，苏木素复染细胞核，自来水返蓝，脱水、透明、封片，光学显微镜下观察NGAL和cleaved caspase-3的变化情况。

2.6Western blot检测肾组织中NGAL、SMYD2、H3K36me3、p-P53、P53、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、STAT3、p-STAT3、JNK和p-JNK1/2/3等蛋白水平的变化称取0.020 g肾组织加入蛋白裂解液充分研磨裂解，4 ℃离心20 min取上清，应用BCA法测定蛋白浓度，配制蛋白样本。配制SDS-PAGE凝胶，上样、电泳、转膜、封闭。分别加入 I 抗：NGAL(1∶800)、SMYD2(1∶500)、H3K36me3(1∶1 000)、p-P53(1∶500)、P53(1∶500)、Bax(1∶750)、Bcl-2(1∶500)、cleaved caspase-3(1∶300)、p-STAT3(1∶2 000)、STAT3(1∶1 500)、JNK(1∶1 000)、p-JNK1/2/3(1∶1 000)和β-actin(1∶5 000)，4 ℃摇床孵育过夜。TBST洗膜，孵育相应II抗，TBST洗膜，ECL显影曝光，Bio-Rad凝胶成像系统扫描，ImageJ 1.6软件进行分析各条带的灰度值，以β-actin为内参照，目的蛋白与β-actin的比值进行后续的统计学分析。

3 统计学处理

采用SPSS 23.0统计软件对数据进行统计学分析，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较用独立样本t检验，相关性分析采用Pearson相关分析法。以P<0.05为差异具有统计学意义。

结果

1 肾功能变化

与sham组相比，IR组的BUN和SCr水平显著升高(P<0.05)，见表1。

表1 小鼠BUN和SCr水平

Table 1.The results of BUN and SCr in each group (Mean±SD.n=15)

GroupBUN (mmol/L)SCr (μmol/L)sham5.48±0.847.13±1.36IR65.02±6.22*157.50±9.07*

*P<0.05vssham group.

2 肾组织病理学改变

HE染色结果显示，sham组肾小球及肾小管结构清晰，肾小管上皮细胞未见明显水肿、脱落和坏死；IR组可见肾小管上皮细胞肿胀、脱落、坏死，肾小管上皮细胞刷状缘脱落，管腔内大量细胞碎屑残留，肾小球未见明显病变，见图1。

Figure 1.The pathophysiological changes in the kidney of mice (HE staining). The green arrow indicates edema of renal epithelial cells; the red arrow indicates the fragments of renal epithelial cells.

图1 小鼠肾组织病理学改变

3 肾组织中NGAL和cleaved caspase-3的变化

IHC染色结果显示，与sham组相比，IR组肾小管上皮细胞中NGAL和cleaved caspase-3明显增多，见图2。

4 肾组织NGAL、SMYD2、H3K36me3、p-P53、P53、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、p-STAT3、STAT3、JNK和p-JNK1/2/3等蛋白水平的变化

Western blot结果显示，与sham组相比，IR组NGAL、SMYD2和H3K36me3的蛋白水平明显增加(P<0.05)，见图3。IR组的p-P53、cleaved caspase-3和Bax的蛋白水平明显增加(P<0.05), Bcl-2表达水平明显下调(P<0.05)，P53表达水平不变，见图4。IR组的STAT3、p-STAT3、JNK和 p-JNK1/2/3的蛋白水平均明显增加(P<0.05)，见图5。

Figure 2.The expression of NGAL and cleaved caspase-3 proteins in the kidney of mice detected by immunohistochemical staining (×200).

图2 小鼠肾组织NGAL和cleaved caspase-3蛋白表达

5 肾组织 H3K36me3同SMYD2和NGAL相关性分析

相关性分析结果显示,肾组织H3K36me3同SMYD2和NGAL的变化水平均呈显著正相关，H3K36me3与SMYD2的相关系数r=0.946(P<0.05);H3K36me3与NGAL的相关系数r=0.887(P<0.05)。

讨论

AKI作为各种大型手术和器官移植常见的严重并发症，如何有效的预防和治疗成为了国内外学者研究的热点。越来越多的研究表明[11]，表观遗传修饰与AKI的发病机制密切相关，因此，进一步研究表观遗传修饰在AKI发生发展中的作用，将为AKI的防治提供新的方向。

Figure 3.The protein levels of NGAL, SMYD2 and H3K36me3 in the kidney of mice. Mean±SD.n=15.*P<0.05vssham group.

图3 小鼠肾组织中NGAL、SMYD2和H3K36me3蛋白水平的变化

研究表明，在肾IR 24 h后，肾组织中的NGAL表达明显增加，提示NGAL可作为AKI早期诊断的标志物[12]。本研究结果显示，在IR诱导AKI小鼠肾组织中NGAL表达明显增加(P<0.05)，与国内外研究结果一致[13],同时结合本研究中小鼠肾功能及肾组织形态学改变结果提示，IR-AKI小鼠模型构建成功。研究发现，单侧输尿管结扎诱导肾脏纤维化的小鼠肾组织中H3K9me1表达上调[14]，IR诱导的肾损伤小鼠肾组织中H3K4me3表达上调[15]，提示组蛋白甲基化水平增高可能与肾脏疾病的发生发展密切相关。本研究发现，在IR诱导AKI小鼠肾组织中，H3K36me3和SMYD2表达明显增加，同时伴有小鼠肾功能障碍，肾小管上皮细胞坏死和细胞凋亡增加，提示H3K36me3表达上调可能参与了IR-AKI肾损伤的发生。目前关于H3K36me3在IR-AKI发生发展中的作用及机制尚未见其他研究报道。

Figure 4.The protein levels of p-P53， P53， cleaved caspase-3, Bax and Bcl-2 in the kidney of mice. Mean±SD.n=15.*P<0.05vssham group.

图4 小鼠肾组织中p-P53、P53、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白水平的变化

AKI的发病机制复杂，参与因素和涉及事件众多，包括肾近端小管损伤、氧化应激反应和炎症反应[16]。肾近端小管损伤涉及不同的病理反应，主要包括炎症、细胞凋亡、坏死和线粒体功能障碍等[17]。本研究结果表明，sham组小鼠肾组织中未出现明显细胞凋亡，IR组小鼠肾组织中凋亡细胞明显增加，且伴有肾小管上皮细胞刷状缘脱落，管腔内大量细胞碎屑残留，肾组织损伤明显，提示肾IR损伤时，细胞凋亡明显增加，参与介导了AKI的发生。细胞凋亡受多种凋亡基因及凋亡蛋白的调控，P53是介导细胞凋亡重要的调控基因之一[18]。研究表明，在肾IR损伤时，P53蛋白表达增加，可激活凋亡相关蛋白Bax的表达，抑制抗凋亡相关蛋白BCL-2蛋白的表达，介导细胞凋亡的发生[19]。本研究结果表明，在IR-AKI小鼠肾组织中p-P53蛋白及凋亡相关蛋白cleaved caspase-3和Bax表达明显增加，抗凋亡蛋白BCL-2蛋白表达明显下降，提示IR-AKI时，肾组织中P53表达增加，可能参与介导了细胞凋亡的产生。

大量研究表明，当肾IR损伤时可激活一系列细胞凋亡信号通路[20-22]，包括P53介导的细胞凋亡信号通路和非P53依赖的细胞凋亡信号通路。本研究结果表明，在肾IR损伤时，肾组织中p-P53、p-STAT3和p-JNK1/2/3的蛋白水平明显增加，提示IR-AKI时，肾组织中P53表达增加，可能同时激活了STAT3和JNK相关的细胞凋亡信号通路，介导了细胞凋亡。另外，Li LX等研究发现，SMYD2和H3K36me3的上调可导致STAT3在赖氨酸685处甲基化，然后磷酸化进而活化，以调节囊性肾上皮细胞凋亡，药物干预可减少细胞凋亡的发生[8]，但H3K36me3在IR-AKI肾损伤及肾组织细胞凋亡中的作用目前尚无相关文献报道。本研究相关性分析结果显示，H3K36me3与SMYD2和NGAL的水平均呈明显正相关，结合上述结果，提示H3K36me3表达的上调可能受SMYD2的调控，其可能参与了STAT3或JNK介导的IR-AKI肾损伤及肾组织细胞凋亡的发生。