IP3R在LH-EGFR诱导小鼠卵母细胞第一次减数分裂恢复中的作用*

郝肖琼， 李延康， 付旭阳， 贾方毅

(1包头医学院生理学教研室， 2内蒙古包钢医院， 内蒙古 包头 014040)

在排卵前卵泡中，卵泡壁层颗粒细胞表达的C型利尿钠肽(C-type natriuretic peptide, NPPC)与表达在卵丘颗粒细胞中的利尿钠肽受体2(natriuretic peptide receptor 2, NPR2)结合，产生的环鸟苷酸(cyclic guanosine monophosphate, cGMP)通过缝隙连接进入卵母细胞，维持了卵母细胞减数分裂的阻滞[1]。在每个生殖周期中，由下丘脑垂体前叶释放的促黄体素(luteinizing hormone, LH)激活卵泡壁层颗粒细胞中的促黄体素受体(luteinizing hormone receptor, LHR)，导致卵母细胞减数分裂的恢复。激活LHR能够降低NPPC mRNA的表达，同时降低了NPPC蛋白的含量[2]，而我们近期的研究发现，在NPPC存在的情况下，LH可通过降低NPR2活性诱导卵母细胞减数分裂的恢复[3]，这表明在减数分裂恢复过程中，NPR2的失活起着至关重要的作用。LH本质上通过促进颗粒细胞中表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)的表达转激活卵丘细胞中的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)发挥作用[4]。我们近期的研究表明，LH-EGFR信号动员内质网钙库升高了卵丘细胞内的钙离子水平，导致NPR2与NPPC的亲和性降低，使NPR2失活，卵母细胞恢复减数分裂[3]；早期也有研究表明，在稳定表达NPR2的293T细胞系中，钙离子能够降低NPR2的磷酸化水平，使NPR2失活[5]。这些结果说明钙离子在降低NPR2活性的过程中发挥着重要作用，然而，LH-EGFR信号究竟怎样升高卵丘细胞内钙离子水平诱导卵母细胞减数分裂恢复，目前还不清楚。

细胞内钙库储存在内质网的膜系统中，胞内钙库的释放是由多种通路调控的，磷脂酰肌醇信号通路是十分重要的一种，许多胞外刺激物可激活磷脂酰肌醇信号通路，导致1,4,5-三磷酸肌醇受体(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor, IP3R)介导钙库释放钙离子[6]。IP3R是一种位于内质网的钙离子释放通道[7]，广泛表达于基本所有类型的细胞中[8]。由IP3R调节的钙离子释放过程对许多胞内活动十分重要,如基因转录、细胞增殖、受精、发育、细胞凋亡细胞间通讯和激素分泌等[9]。

在本研究中，我们证明了LH-EGFR信号通路通过IP3R升高卵丘细胞内的钙离子水平，从而使NPR2失活，cGMP下降，导致卵母细胞减数分裂恢复。

材 料 和 方 法

1 实验动物

21～23日龄(12～14 g)雌性C57BL/6J小鼠共150只，全部用于注射孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin, PMSG)，之后取卵巢内卵丘-卵母细胞复合物(cumulus-oocyte complexes, COCs)用于实验。小鼠购于中科院遗传所实验动物中心，许可证号为SCXK (京) 2015-0019，于SPF级实验动物房饲养，22～24 ℃恒温，12 h/12 h交替光照/黑暗，自由采食饮水。

2 实验试剂与仪器

PMSG(浙江宁波激素厂);NPPC、EGF、2-氨乙基二苯基硼酸酯(2-aminoethyl diphenyl borate, 2-APB)、肝素(heparin)和LH(Sigma)；Fluo 3-AM(日本同仁化学研究所)；MEMα粉末状培养基(Gibco)；胎牛血清(FBS;Thermo)；RNA提取试剂盒RNeasy Micro Kit和RNA反转录试剂盒QuantiTect (Qiagen)；TransStart Green qPCR SuperMix(全式金公司)；cGMP检测试剂盒(Cayman)。

体式镜 (Lecia)；A1激光共聚焦显微镜(Nikon)；real-time PCR仪(Appiled Biosystems)；细胞培养膜(Millipore)。

3 实验方法

3.1COCs的分离及培养 小鼠腹腔注射PMSG,每只5 U，44～48 h后颈椎脱臼处死，分离卵巢，刺破卵泡，挑选形态良好，卵丘细胞包裹均匀的COCs。实验分组如下：对照(control)组(仅添加30 nmol/L NPPC)、NPPC+10 μg/L EGF组、NPPC+10 μg/L EGF+不同剂量2-APB组、NPPC+10 μg/L EGF+不同剂量Heparin组、10 μmol/L 2-APB组以及200 mg/L heparin组，将COCs置于按实验分组不同预先添加了不同试剂的MEMα培养液中，于37 ℃、5% CO2培养箱进行培养；培养4 h后，将卵丘细胞去掉，观察并统计卵母细胞生发泡破裂(germinal vesicle breakdown, GVBD)的百分率(GVBD%)，卵母细胞内无明显生发泡(germinal vesicle, GV)即认为发生GVBD，GVBD%代表卵母细胞减数分裂恢复情况。每次实验每组使用30枚COCs。

3.2卵泡的分离及培养 卵巢取自注射PMSG 44～48 h的小鼠卵巢，用1 mL注射器分离卵泡，选择直径约为300～400 μm、反应良好的卵泡，将分离好的卵泡置于孔径0.44 μm的细胞培养膜上。实验分为4组：control组、1 mg/L LH组、 LH+10 μmol/L 2-APB组以及LH+200 mg/L heparin组。培养膜悬浮放置在按实验分组不同预先添加不同试剂的MEMα培养液中，于37 ℃、5% CO2培养箱进行培养；4 h后，刺破卵泡，将卵丘细胞去掉以观察卵母细胞减数分裂恢复情况。每次实验每组使用15枚卵泡。

3.3卵丘扩展 COCs取自注射PMSG 44～48 h的小鼠卵巢，实验分为4组：control组(仅添加30 nmol/L NPPC)、NPPC+10 μg/L EGF组、NPPC+10 μg/L EGF+10 μmol/L 2-APB以及NPPC+10 μg/L EGF+200 μmol/L heparin组。MEMα培养液按处理组不同预先添加不同试剂待用，各组培养液额外添加5% FBS帮助细胞贴壁；吸取按不同实验处理组准备好的添加了不同试剂的培养液制作微滴，每个微滴体积10 μL，微滴置于玻底培养皿中以便后续拍照记录，将COCs置于不同处理组的微滴中，覆盖石蜡油，于37 ℃，5% CO2培养箱进行培养；12～16 h后结束培养，观察卵丘扩展情况。每次实验每组使用15枚COCs。

3.4RNA的提取 COCs取自注射PMSG 44～48 h的小鼠卵巢，实验分组同3.3，COCs置于按实验分组不同预先添加不同试剂的MEMα培养液中培养，6 h后，收集COCs，总RNA提取依照RNeasy Micro Kit操作指南进行，总RNA的反转录依照QuantiTect反转录体系进行，得到cDNA。

3.5real-time PCR 采用25 μL体系：TransStart Green qPCR SuperMix 12.5 μL，Forward Primer 1 μL，Reverse Primer 1 μL，Dye 0.5 μL，ddH2O 8 μL，cDNA 2 μL。在ABI 7500 Real-Time PCR系统下进行反应，每个样品重复3次，所有实验重复3次。实验所用引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，序列见表1。

表1 Real-time PCR 引物序列

F: forward; R: reverse.

3.6细胞内钙离子水平检测 COCs取自注射PMSG 44～48 h的小鼠卵巢，实验分组同3.3，COCs置于按实验分组不同预先添加不同试剂的MEMα培养液中培养2 h，PBS清洗，加入5 μmol/L钙离子荧光探针Fluo 3-AM，于37 ℃、5% CO2培养箱孵育20 min，之后PBS清洗，在A1激光共聚焦显微镜下观察细胞内钙离子水平，绿色荧光表示胞内钙离子水平，荧光强度代表胞内钙离子水平相对值。每次实验每组使用15枚COCs。

3.7cGMP水平检测 COCs取自注射PMSG 44～48 h的小鼠卵巢，实验分组同3.3，COCs置于按实验分组不同预先添加不同试剂的MEMα培养液中培养(每组需100枚COCs)，2 h后结束培养，PBS清洗，收集各组COCs，cGMP含量依据cGMP酶联免疫试剂盒(Cayman)中提供的方法进行检测。

4 统计学处理

实验数据以均数±标准误(mean±SEM)表示，统计推断采用方差分析(ANOVA)和SNK-q检验，用SigmaPlot 13.0软件进行统计分析并作图，以P<0.05为差异具有统计学显著性。

结 果

1 IP3R抑制剂2-APB和heparin抑制EGF诱导的卵母细胞减数分裂恢复

IP3R是一种调控内质网钙库钙离子释放的重要通道。我们研究了EGF是否通过IP3R升高胞内钙离子水平。结果表明，EGF促进了卵母细胞减数分裂的恢复，GVBD%为(91.42±0.72)%，而IP3R的抑制剂2-APB和heparin能有效抑制EGF诱导的卵母细胞减数分裂恢复(P<0.05)，GVBD%分别为(52.58±1.45)%和(47±1.22)%,见图1A；且2-APB与Heparin的抑制作用是剂量依赖性的,见图1B、C。这些结果表明，IP3R在EGF诱导的卵母细胞减数分裂恢复中发挥重要作用。

2 IP3R抑制剂2-APB和heparin抑制EGF诱导的卵丘扩展

EGF在诱导卵母细胞减数分裂恢复的过程中伴随着卵丘扩展，卵丘扩展对于卵子的正常受精至关重要。因此，我们检测了2-APB及heparin在EGF诱导的卵丘扩展中的作用。结果表明，与对照组相比，EGF促进了卵丘细胞的扩展与卵丘扩展因子的表达，而2-APB及heparin均能显著抑制EGF诱导的卵丘扩展现象，且卵丘扩展因子Has2、Ptgs2、Ptx3与Tnfaip6的表达量较EGF组均显著降低(P<0.05)，见图2。这一结果表明IP3R也参与了EGF诱导的卵丘扩展。EGF诱导减数分裂恢复与卵丘扩展往往并行，且有研究表明，钙离子在卵丘扩展过程中也发挥重要作用[10]。本结果进一步说明了IP3R在减数分裂恢复过程中的重要意义。

Figure 1.The effect of 2-APB and heparin on EGF-induced meiotic resumption. A: COCs were cultured in MEMα medium containing 30 nmol/L NPPC alone, or supplemented with 10 μg/L EGF, 10 μg/L EGF+10 μmol/L 2-APB or 10 μg/L EGF+200 mg/L heparin; B: the dose-dependent effects of 2-APB on oocyte meiotic resumption; C: the dose-dependent effects of he-parin on oocyte meiotic resumption. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsEGF group;△P<0.05vs2-APB group;▲P<0.05vsheparin group.

图1 2-APB及heparin对EGF诱导卵母细胞减数分裂恢复的影响

3 IP3R抑制剂2-APB和heparin抑制EGF诱导的卵丘细胞内钙离子水平升高

激活IP3R钙离子通道导致细胞内钙离子水平升高，接下来我们研究了2-APB和heparin对EGF诱导的胞内钙离子水平升高的影响，钙离子探针Fluo 3-AM作为胞内钙离子水平变化的指示剂。研究结果表明，对照组钙离子荧光(绿色荧光)强度微弱，添加EGF后，卵丘细胞内钙离子荧光强度明显增加，这与之前的研究[11]结果相同，接着，我们添加了2-APB和heparin，发现这2种抑制剂均能明显抑制EGF诱导的胞内钙离子水平升高，且钙离子荧光强度也显著降低(P<0.05),见图3。这些结果表明，EGF可能通过激活IP3R钙离子通道导致卵丘胞内钙离子水平升高，诱导卵母细胞减数分裂恢复，若阻断IP3R的作用，则EGF不能诱导胞内钙离子水平的升高，那么卵母细胞也无法恢复减数分裂。

4 IP3R抑制剂2-APB和heparin对COCs中cGMP水平的影响

NPPC处理后COCs中cGMP水平是否升高能够代表NPR2鸟苷酸环化酶的活性，卵丘细胞内钙离子水平升高诱导卵母细胞减数分裂恢复，本质上是高水平的钙离子导致了NPR2的失活，使cGMP水平下降。因此，我们研究了2-APB和heparin在EGF诱导减数分裂恢复过程中对COCs内cGMP水平的影响。同之前的研究[1]结果一致，NPPC处理2 h后，COCs中cGMP含量明显上升，添加EGF降低了胞内cGMP水平(P<0.05)，然而，EGF的降低作用能够被2-APB和heparin显著逆转(P<0.05),见图4。这一结果表明，EGF通过IP3R升高卵丘细胞内钙离子水平，使NPR2失活，cGMP水平下降，最终诱导卵母细胞减数分裂的恢复。

Figure 2.The effect of 2-APB and heparin on EGF-enabled cumulus expansion.COCs were cultured in MEMα medium containing 30 nmol/L NPPC alone, or supplemented with 10 μg/L EGF, 10 μg/L EGF+10 μmol/L 2-APB or 10 μg/L EGF+200 mg/L heparin. A: morphological changes of cumulus expansion with different treatments after 12～16 h of culture; B: real-time PCR results forHas2,Ptgs2,Ptx3andTnfaip6in cumulus cells. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsEGF group.

图2 2-APB及heparin对EGF诱导的卵丘扩展的影响

Figure 3.The effect of 2-APB and heparin on EGF-mediated calcium elevation.COCs were cultured in MEMα medium containing 30 nmol/L NPPC alone, or supplemented with 10 μg/L EGF, 10 μg/L EGF+10 μmol/L 2-APB or 10 μg/L EGF+200 mg/L heparin.Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsEGF group.

图3 2-APB及Heparin对EGF诱导卵丘细胞内钙离子水平升高的影响

Figure 4.The effect of 2-APB and heparin on cGMP level in COCs.COCs were cultured in MEMα medium containing 30 nmol/L NPPC alone, or supplemented with 10 μg/L EGF, 10 μg/L EGF+10 μmol/L 2-APB or 10 μg/L EGF+200 mg/L heparin. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsEGF group.

图4 2-APB及heparin对COCs内cGMP水平的影响

5 IP3R抑制剂2-APB和heparin抑制LH诱导的卵母细胞减数分裂恢复

前面的研究中，我们在COCs体外培养模型下，证明EGF通过IP3R升高胞内钙离子水平，使NPR2失活，导致cGMP水平的下降，卵母细胞减数分裂恢复。为了进一步模拟生理环境，我们使用卵泡培养模型，探究IP3R在LH诱导的卵母细胞减数分裂恢复过程中是否发挥作用。研究结果表明，LH促进减数分裂的恢复，GVBD%为(91.00±1.15)%，而2-APB和heparin显著抑制了LH诱导的减数分裂恢复(P<0.05)，GVBD%分别(51.33±1.45)%和(46.75±0.94)%，见图5。LH本质上通过激活EGFR发挥作用，因此，本结果证明LH-EGFR信号确实通过IP3R升高胞内钙离子水平，使NPR2失活，cGMP水平下降，减数分裂恢复。

讨 论

排卵前卵泡中的卵母细胞一直阻滞在减数分裂I前期的双线期，NPPC与其受体NPR2结合，产生的cGMP是维持减数分裂阻滞的关键因子[1]，LH通过促进颗粒细胞中EGF样生长因子的表达[12]，转激活卵丘细胞中的EGFR，诱导卵母细胞恢复减数分裂[4]。前期的研究表明，激活EGFR升高卵丘细胞内钙离子水平，导致NPR2与NPPC的亲和性下降，使NPR2失活，cGMP水平下降，卵母细胞恢复减数分裂。本研究中，我们发现LH-EGFR信号通过IP3R升高卵丘细胞内钙离子水平，诱导卵母细胞减数分裂的恢复。

Figure 5.The effect of 2-APB and heparin on LH-induced meio-tic resumption. Follicles were cultured with MEMα medium alone, or supplemented with 1 mg/L LH, 1 mg/L LH+10 μmol/L 2-APB or 1 mg/L LH+200 mg/L heparin. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsEGF group.

图5 2-APB及heparin对LH诱导的减数分裂恢复的影响

细胞内钙信号作为调节细胞活动的重要信使，参与了多种细胞生理反应。胞内高水平钙离子一方面来源于质膜钙泵的开放，使胞外钙离子内流，另一方面来源于内质网钙库的释放。我们前期的研究已经证明，激活EGFR升高卵丘细胞内钙离子水平，使NPR2失活，cGMP水平下降，卵母细胞恢复减数分裂，而EGF诱导的卵丘细胞内高水平钙离子来源于内质网钙库的释放[3]。IP3R和兰尼碱受体(ryano-dine receptor, RyR)均为内质网钙释放通道，我们发现RyR的抑制剂tetracaine并不能抑制EGF诱导的卵母细胞减数分裂恢复(结果未显示)，然而，IP3R的抑制剂2-APB和heparin却能剂量依赖性的抑制EGF诱导的减数分裂恢复，此外，2-APB和heparin有效抑制了EGF升高的卵丘细胞内钙离子水平，钙离子水平的升高是EGF促进减数分裂恢复的关键原因。这些结果表明IP3R在EGF诱导的卵母细胞减数分裂恢复中发挥作用，EGF激活IP3R钙离子通道，使内质网钙库释放钙离子，导致了卵丘细胞内具有高水平钙离子。然而，2-APB和heparin并不能完全逆转EGF诱导的减数分裂恢复，提示可能还有其它互补途径，这需要进一步的研究。

我们发现2-APB和heparin同样能够抑制EGF诱导的卵丘细胞扩展，卵丘扩展与卵母细胞减数分裂恢复的时空调控对于正常的排卵进程至关重要，而激活IP3R钙离子通道升高了胞内钙离子水平，说明钙离子可能也参与了EGF诱导的卵丘扩展，这与之前的报道一致[10]，同时，这些结果也表明了钙离子对减数分裂的作用不仅是单一的促成熟，还能够促进卵丘扩展，钙离子的这些作用能够确保卵子正常的成熟与排卵。

EGF通过IP3R升高卵丘细胞内钙离子水平，而钙离子的重要意义在于使NPR2失活，导致cGMP水平下降，最终破坏卵母细胞减数分裂的阻滞状态[13-14]。2-APB和heparin不但抑制了EGF诱导的卵丘细胞内钙离子水平升高，还能够有效逆转EGF介导的胞内cGMP水平降低，这说明IP3R介导的卵丘细胞内高水平钙离子导致了NPR2的失活，使cGMP水平下降，最终促进卵母细胞减数分裂的恢复。之前的结果表明钙离子可使NPR2失活[15]，我们的结果也与之一致。

由于卵丘细胞不表达LH受体，因此，LH主要通过激活卵丘细胞中的EGFR发挥作用，2-APB和he-parin同样抑制了LH诱导的减数分裂恢复，之前的研究表明LH处理升高了卵丘细胞内钙离子水平导致NPR2失活[3]，结合此结果，说明LH-EGFR信号通过IP3R升高卵丘细胞内钙离子水平，高水平钙离子使NPR2失活，cGMP水平下降，最终诱导卵母细胞减数分裂的恢复。

本研究结果进一步阐明了卵母细胞减数分裂恢复的分子机理，为临床辅助生殖中建立更为完善的卵母细胞体外成熟体系、提高卵母细胞体外成熟质量提供了科学依据。

致谢：感谢中国农业大学生物学院张美佳教授在论文写作过程中给予的指导。