湖北省兴山县大型子囊菌物种多样性研究

王 睿,张 鲜,高 扬,陈双林,闫淑珍

(南京师范大学生命科学学院,江苏 南京 210023)

对特定区域进行生物多样性调查研究,是开展生物多样性保护、物种生存状态评价和合理开发利用物种资源的重要基础性工作[1]。真菌是生物多样性的重要组成类群,是自然生态系统中的分解者。子囊菌门是真菌界最大的类群,约有90 000种[2]。大型子囊菌一般为肉眼可见,子囊果直径>1 mm 的子囊菌[3],其作用包括分解物质、产生有益代谢产物、生物防治和治理环境污染[4]等。国内外一直非常重视大型真菌多样性,开展的相关研究也较多[5-7],但在特定区域开展大型子囊菌多样性研究则不多见,而且目前对大型子囊菌的研究多集中于系统分类学[8-10]。

对湖北省大型真菌的研究主要集中于神农架林区[11]、后河自然保护区[12]和宜昌市[13]等地[14-16],其中只有中国科学院神农架真菌地衣考察队[11]和陈启武[16]重点关注了区域内大型子囊菌,分别报道30和43种大型子囊菌。目前湖北省已报道大型子囊菌为93种,而兴山县仅报道4种[15-16]。兴山县地处三峡库区范围,地形复杂,气候垂直差异大,且受长江峡谷暖流制约,小气候十分明显,属于北亚热带常绿阔叶与落叶阔叶混交林山地,为大型子囊菌生长提供了适宜条件。大型子囊菌的组成和发生受季节、植被和地点等因素影响,为准确认识和掌握大型子囊菌资源多样性,需要开展系统性调查研究。为全面掌握湖北省兴山县大型子囊菌物种资源多样性,丰富对三峡库区生物多样性的认识,于大型子囊菌发生的主要季节对兴山县全域进行大型子囊菌资源调查、标本收集和物种研究。

1 材料与方法

1.1 标本采集和资源调查

分别于2016年10月、2017年4—10月以及2018年6和8月,在湖北省宜昌市兴山县进行大型子囊菌资源调查。兴山县位于31°04′～31°34′ N,110°25′～111°06′ E,地貌属秦岭大巴山体系,气候属亚热带大陆性季风气候区。根据设置的调查网格,在分布于兴山县6个乡镇的20个采集点采集大型子囊菌标本,同时记录标本编号、地理信息和生境信息等基本信息(图1、表1)。

图1 兴山县大型子囊菌调查地点分布

表1 兴山县大型子囊菌物种资源调查采样地点信息

Table 1 Information list of the investigating points for macro-ascomycetes in Xingshan County

采集点所在乡镇海拔/m林分类型 象鼻嘴高桥乡700～800针阔混交林 伍家坪高桥乡1 100～1 200落叶阔叶林 孟家陵林场高阳镇1 200～1 350针阔混交林 平水村古夫镇350～450落叶阔叶林 郑院古夫镇700～800针阔混交林 竹园河村古夫镇450～550落叶阔叶林 黄家湾黄粮镇800～900针阔混交林 马家山黄粮镇1 400～1 500常绿阔叶林 龙门河南阳镇1 400～1 600常绿落叶阔叶混交林 落步河南阳镇900～920常绿阔叶林 庙垭南阳镇850～950常绿落叶阔叶混交林 万朝山南阳镇1 150～1 250常绿落叶阔叶混交林 文武村南阳镇200～300常绿阔叶林 后坪林场水月寺镇1 500～1 600针叶林 野竹池水月寺镇1 100～1 200常绿落叶阔叶混交林 板庙榛子乡1 250～1 300常绿落叶阔叶混交林 桥沟榛子乡1 380～1 450针阔混交林 青龙口榛子乡1 500～1 550常绿落叶阔叶混交林 石板湾榛子乡1 280～1 300常绿落叶阔叶混交林 石佛寺榛子乡1 450～1 550常绿落叶阔叶混交林

每份标本分为两个部分,一部分烘干干燥,作永久保留;另一部分采用硅胶干燥后,装入密封袋中,用于分子系统学研究。凭证标本保存于南京师范大学微生物菌种保藏中心(microbial cultures center of Nanjing Normal University,MCCNNU)。

1.2 研究方法

大型子囊菌鉴定和分类学研究主要依靠比较形态学方法和分子生物学技术。形态学研究时综合大型子囊菌标本的宏观特征、显微结构和标本材料与化学试剂反应特征,同时参照有关大型子囊菌分类文献[17-19]。采用分子生物学方法鉴定时采用CTAB法[20]提取标本全基因组DNA,PCR扩增并测序nrDNA-ITS和nrDNA-LSU基因片段,引物分别为ITS1/ITS4[21]和LR0R/LR5[22]。PCR扩增体系为25 μL,引物各1 μL,DNA模板1 μL,2×Taq Master Mix 12.5 μL,ddH2O 10.5 μL。ITS-PCR反应程序为94 ℃反应4 min,94 ℃反应30 s,50 ℃反应30 s,72 ℃反应2 min,循环35次,最后72 ℃反应10 min。LSU-PCR反应程序为:94 ℃反应4 min,94 ℃ 反应30 s,56 ℃反应45 s,72 ℃反应75 s,循环35次,最后72 ℃反应10 min。PCR产物经ρ为1%琼脂糖凝胶电泳检验合格后,送交上海生工生物工程股份有限公司进行测序。测序后分别对所得ITS和LSU序列进行BLAST比对,采用MEGA 7软件基于最大似然法、邻接法和最大简约法等方法建立系统发育树并结合形态特征进行物种鉴定。

通过基于LSU序列建立的大型子囊菌系统发育树进行系统发育关系分析,所用序列来源为该研究获得和NCBI(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载所得。系统发育关系分析流程为采用Mafft 7.149软件进行序列比对,采用Gblocks 0.91b软件选择保守区域,采用Jmodeltest 2.1.7软件选择进化模型为GTR+G,采用RaxmlGUI 1.3.1软件构建最大似然树,采用MrBayes 3.2.6软件构建贝叶斯树,最后采用Figtree 1.4.3和Adobe Illustrator CS5 15.0.0软件查看和编辑所构建的系统发育树。

2 结果与分析

2.1 兴山县大型子囊菌种类组成

从兴山县共采集大型子囊菌标本339份,鉴定为96种,隶属于4纲5目20科48属,其中,杯紫胶盘菌(Ascocorynecylichnium)、橘色小双孢盘菌(Bisporellacitrina)和波托绿杯菌(Chlorociboriapoutoensis)等40种为在湖北省首次发现(表2)。

表2 湖北省兴山县大型子囊菌种类名录

Table 2 The species list of Macro-ascomycetes in Xingshan County, Hubei Province

科种数代表物种发生季节春季夏季秋季营养类型分布地点数 绿杯盘菌科(Chlorociboriaceae)2波托绿杯菌(Chlorociboria poutoensis)1)-++木生1 地锤菌科(Cudoniaceae)1地匙菌(Spathularia flavida)-+-土生1 皮盘菌科(Dermateaceae)2乌黑布齿盘菌(Graddonia coracina)1)-+-木生1 柔膜菌科(Helotiaceae)6杯紫胶盘菌(Ascocoryne cylichnium)1)-++木生2 粒毛盘菌科(Lachnaceae)3异常粒毛盘菌(Lachnum abnorme)++-木生10 锤舌菌科(Leotiaceae)1润滑锤舌菌(Leotia lubrica)-++土生5 蜡盘菌科(Rutstroemiaceae)1长柄兰斯盘菌(Lanzia longipes)-+-木生2 核盘菌科(Sclerotiniaceae1橙红双头孢盘菌(Dicephalospora rufocornea)-+-木生4 虫草菌科(Cordycipitaceae)5蛹虫草(Cordyceps militaris)+++虫生4 肉座菌科(Hypocreaceae)3马鞍菌寄生菌(Hypomyces cervinigenus)1)-+- 菌寄生1 线孢虫草科(Ophiocordycipitaceae)5下垂线虫草(Ophiocordyceps nutans)-+-虫生5 圆盘菌科(Orbiliaceae)4肿丝圆盘菌(Orbilia inflatula)+--木生1 平盘菌科(Discinaceae)1黄褐鹿花菌(Gyromitra leucoxantha)+--木生1 马鞍菌科(Helvellaceae)8马鞍菌(Helvella elastica)-++土生3 羊肚菌科(Morchellaceae)1羊肚菌(Morchella esculenta)+--土生2 盘菌科(Pezizaceae)12米氏盘菌(Peziza michelii)1)-++土生7 火丝菌科(Pyronemataceae)17伊迈饰孢盘菌(Aleurina imaii)1)-+-土生3 肉杯菌科(Sarcoscyphaceae)9中华歪盘菌(Phillipsia chinensis)-++木生4 肉盘菌科(Sarcosomataceae)2暗盘菌(Plectania melastoma)1)++-木生6 炭角菌科(Xylariaceae)12山地炭团菌(Hypoxylon monticulosum)+--木生4

1)湖北省新记录种。发生季节中春季为4—5月,夏季为6—8月,秋季为9—10月。“+”表示有发生,“-”表示没有发生。

由表2可知，优势属为盘菌属(Peziza)(9种)、马鞍菌属(Helvella)(8种)和炭角菌属(Xylaria)(7种),分别占总物种数的9.38%、8.33%和7.29%。优势科为火丝菌科(17种)、盘菌科(12种)和炭角菌科(12种),分别占总物种数的17.71%、12.50%和12.50%。优势目为盘菌目,包括50个物种,占总物种数的52.08%。兴山县分布较广泛的大型子囊菌为异常粒毛盘菌(Lachnumabnorme)、米氏盘菌(Pezizamichelii)、甜盘菌(Pezizasuccosa)、半球土盘菌(Humariahemisphaerica)、蛾蛹虫草(Cordycepspolyarthra)和暗盘菌(Plectaniamelastoma)等20种,占总物种数的20.81%;兴山县分布较不普遍的大型子囊菌为绿杯盘菌(Chlorociboriaaeruginosa)、地匙菌(Spathulariaflavida)和蝉棒束孢(Isariacicadae)等76种,仅在1～2个采集点发现,占总物种数的79.17%。其中,88个物种分布在海拔800～1 600 m的区域,占总物种数的91.67%;77个物种分布在常绿落叶阔叶混交林中,占总物种数的80.21%。分布最广泛大型子囊菌为异常粒毛盘菌,分布于10个采集点,海拔范围为400～1 600 m,并存在于针叶林、落叶阔叶林、常绿阔叶林、常绿落叶阔叶混交林和针阔混交林等林分类型。

从生长季节来看,夏季发生的大型子囊菌明显多于春秋两季,有85种之多,占总物种数的85.42%。仅在春或秋季发生的大型子囊菌之和占总物种数的25.00%。而3个季节都有发生的大型子囊菌为蛹虫草(Cordycepsmilitaris)和蛾蛹虫草,仅占总物种数的2.08%。有些物种表现出较强的季节性,如羊肚菌(Morchellaesculenta)发生于春季(4—5月),暗盘菌多发生于春夏之交(5—6月),大孢毛杯菌(Cookeinainsititia)、中华歪盘菌(Phillipsiachinensis)、西方肉杯菌(Sarcoscyphaoccidentalis)等物种多发生于夏秋季(8—10月)。

从营养类型来看,土生、木生、虫生、菌寄生以及土生和木生兼生的大型子囊菌分别为41、40、10、2和3种,分别占总物种数的45.83%、44.79%和10.41%,其中半球土盘菌(Humariahemisphaerica)、钝刺盾盘菌(Scutelliniatrechispora)和古巴炭角菌(Xylariacubensis)既可木生又可土生。除此之外,还发现2种真菌寄生菌。柔膜菌目大部分科属都是木生,仅有地锤菌科地匙菌属(Spathularia)和锤舌菌科锤舌菌属(Leotia)为土生。肉座菌目除虫生的棒束孢属(Isaria)、虫草属(Cordyceps)和线虫草属(Ophiocordyceps)外,还发现肉座菌属(Hypocrea)标本1种,基物为腐木;菌寄生菌属(Hypomyces)标本2种,基物分别为盘菌和马鞍菌。圆盘菌目全部为木生。盘菌目中,羊肚菌科、马鞍菌科、盘菌科都生长在林中地上;唯一1份平盘菌科鹿花菌属(Gyromitra)标本生长于腐木基质上;火丝菌科大部分为土生,但个别物种为木生和土生兼生;肉杯菌科和肉盘菌科大部分为木生,也有如美洲丛耳菌(Wynneaamericana)个别物种为土生。

2.2 兴山县大型子囊菌的系统发育关系

系统发育学分析共采用109条序列,其中包括该研究测得的兴山县大型子囊菌标本57个物种的83条序列,以及从NCBI下载的26条序列。基于LSU序列,构建的最大似然系统发育树和贝叶斯系统发育树具有相同的拓扑结构。由图2可知,兴山县大型子囊菌存在10个系统发育分支,每个分支均具有较高的支持度,基本支持形态学的分类观点。分支Ⅰ由圆盘菌目圆盘菌科圆盘菌属(Orbilia)的肿丝圆盘菌(Orbiliainflatula)独立组成,在系统发育关系上与分支Ⅱ互为平行分支。分支Ⅱ全部属于盘菌目盘菌科,主要由盘菌属的6个物种组成,而盘菌目盘菌科厚盘菌属(Pachyella)的贴厚盘菌(Pachyellaadnata)也交织在此分支内。按照经典分类学处理方法,盘菌目平盘菌科鹿花菌属和羊肚菌科羊肚菌属(Morchella)在亲缘关系上较为接近,它们在系统发育树中共同组成分支Ⅲ,互为姐妹群。分支Ⅳ为较大分支,全部由马鞍菌科马鞍菌属组成,包含1属5种,再与分支Ⅲ互为姐妹群。分支Ⅴ由火丝菌科5属9种组成,分支Ⅵ由盘菌目肉盘菌科暗盘菌属(Plectania)的2个物种组成,分支Ⅴ和分支Ⅵ互为姐妹群。分支Ⅶ由盘菌目火丝菌科刺粉毛盘菌属(Trichaleurina)的窄孢胶陀盘菌(Trichaleurinatenuispora)和盘菌目肉杯菌科5属7种组成。分支Ⅷ由柔膜菌目组成,包括8科9属11种,分支内柔膜菌科囊盾盘菌属(Ascocoryne)与地锤菌科地匙菌属亲缘关系更近。分支Ⅸ全部为肉座菌目,由虫草菌科、肉座菌科和线虫草菌科共6属11种组成。分支Ⅹ全部为炭角菌目炭角菌科,共有1属2种,该分支在系统发育关系上与肉座菌目最为接近。

3 讨论与结论

在湖北省兴山县发现子囊果>0.1 cm的非地衣型大型子囊菌物种4纲5目20科48属96种,这说明兴山县非地衣型子囊菌资源极为丰富。其中,有40种为湖北省首次记载,伊迈饰孢盘菌(Aleurinaimaii)[19]、布氏虫草(Cordycepsbrongniartii)[18]、印度毛杯菌(Cookeinaindica)[17]、神农架被毛孢(Hirsutellashennongjiaensis)[23]、马鞍菌寄生菌(Hypomycescervinigenus)[24]、盘菌寄生菌(Hypomycesstephanomatis)[25]、中华歪盘菌(Phillipsiachinensis)[17]和神农架肉杯菌(Sarcoscyphashennongjiana)[17]等8种在全世界分布都较少,反映兴山县大型子囊菌具有特定的物种组成。目前,国内已知肉杯菌科共有10属33种1变种[17,26],而在兴山县就发现了5属7种,说明该地肉杯菌科物种多样性较高。

兴山县大型子囊菌物种多集中于海拔800～1 600 m,具有典型亚热带常绿落叶阔叶混交林的区域,最具代表性的区域为龙门河、万朝山和榛子乡等地。郑院、平水河村和竹园河村等地海拔为200～800 m,林分类型以落叶阔叶林和针阔混交林为主,大型子囊菌资源较少,主要为柔膜菌目物种,且多生长于枯枝腐木上。后坪林场和孟家陵林场海拔为1 200～1 600 m,林分类型以针叶林为主,大型子囊菌资源也较少,这可能与这些地方植被成分较单一有关。

兴山县西北区域与神农架国家级自然保护区相接,地貌和植被相近。神农架已发现大型子囊菌16科26属51种[11,16,23-25],笔者研究确认兴山县大型子囊菌20科48属96种,两地共有物种包括黄绿盘菌(Chlorospleniumchlora)、蛹虫草、皱柄白马鞍菌(Helvellacrispa)和肿丝圆盘菌(Orbiliainflatula)等16种。神农架发现9种虫草,兴山县也发现9种虫草,两地共有虫草物种5种。神农架发现9种马鞍菌,兴山县发现8种马鞍菌,两地共有马鞍菌物种5种。

加粗的GenBank登录号为NCBI下载的序列,其他为该研究获得的标本序列。

笔者研究未发现兴山县和神农架都曾被报道的鹿花菌(Gyromitraesculenta)[15-16],但发现黄褐鹿花菌(Gyromitraleucoxantha)。笔者在兴山县发现肉座菌科的红棕肉座菌(Hypocrearufa),神农架也曾发现同属物种黄肉座菌(Hypocreaargillacea)[16]。笔者在兴山县发现的大型子囊菌中有80种未曾在神农架发现,这说明兴山县具有独特的大型子囊菌物种组成和丰富的物种资源。

笔者对兴山县大型子囊菌进行的分子系统学研究支持或佐证了子囊菌一些单元的分类处理观点[9-10]。由图2可知，来自兴山县龙门河国家森林公园的1份圆盘菌目圆盘菌科圆盘菌属肿丝圆盘菌在系统发育树上独立成为一个分支,且与盘菌科为平行分支,这支持了圆盘菌目为单目单科,具有独立分类地位的观点[27]。分支Ⅱ主要为盘菌属物种,但厚盘菌属也位于此分支内,这佐证了盘菌属不是单系类群的观点[28]。虽然鹿花菌属与马鞍菌属和羊肚菌属形态特征有些相似,但鹿花菌属与羊肚菌属的系统发育关系更近,而马鞍菌科马鞍菌属5种却独立组成1个分支,这表明鹿花菌属和羊肚菌属与马鞍菌属的系统发育关系并不与形态特征一致[29]。肉盘菌科在系统发育关系方面与火丝菌科更近,而从营养菌丝隔膜的超微结构来看,肉盘菌科与肉杯菌科的关系比其与盘菌目其他科的关系更近[17]。笔者研究中肉盘菌科首先独立构成1个小分支,再与火丝菌科等7属组成1个大分支,然后与肉杯菌科组成的分支成为姐妹群,但由于样本量较少,肉盘菌科与肉杯菌科的系统发育关系还需要进一步深入研究。柔膜菌目构成的分支较复杂,其中柔膜菌科的囊盾盘菌属、小双孢盘菌属和膜盘菌属分属于不同分支,这支持了柔膜菌科不是单系群的观点[8]。在肉座菌目中,虫草菌科与肉座菌科亲缘关系更近,这也证实了前人的研究结论[30]。