基于代谢组学技术研究凤冈锌硒茶对正常大鼠机体代谢调节规律

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(1.遵义医科大学药学院,贵州遵义 563000;2.遵义医科大学基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室,贵州遵义 563000)

凤冈锌硒茶产自贵州省凤冈县,为典型的富锌富硒茶。有学者测定了凤冈县田坝仙人岭公司的几个茶场中凤冈锌硒茶茶叶锌的含量,锌含量最高为82.84 mg/kg,最低为25.66 mg/kg[1]。近年来针对凤冈锌硒茶的生物活性开展了许多研究,研究发现凤冈锌硒茶能明显增加衰老模型小鼠血清Trx(硫氧化还原蛋白)含量,具有延缓衰老的作用[2]。此外还有降脂、肝损伤保护、抑制肿瘤细胞生长等作用[3-5],以上研究多是从疾病模型入手,而茶作为我国的一种常用饮品,多在机体正常时候饮用,通过整体调节发挥效应,然而目前关于凤冈锌硒茶对正常机体的整体代谢调节作用的研究有限。

代谢组学是研究生物体在受到外源性刺激后,其内源性代谢物种类、数量及其变化规律的科学[6]。其整体性的优势和特点,为复杂物质基础的深入研究提供了新的手段,同时还可通过借鉴国际通行的医药标准研究规范来研究生命体的规律,从而去认识疾病的本质以及阐明药品食品等的功效、作用机理等[7]。近年来,许多学者基于代谢组学对茶做出了大量的研究。如刘建等[8]基于1H-NMR的代谢组学技术探讨了普洱茶茶褐素对高脂大鼠的降血脂机制,筛选出缬氨酸等6种标志代谢物,揭示其机制可能与氨基酸代谢、能量代谢等代谢途径有关,而Xiang等[9]基于代谢组学研究发现藤茶可通过Akt信号通路改善2型糖尿病大鼠的葡萄糖和脂质代谢紊乱。

气质联用(Gas Chromatography-Mass Spectrometer,GC-MS)在化学、生物和环境分析中已经得到广泛的应用,因其具有高效、可重复性、高灵敏度和代谢物易鉴定等技术优势,常作为代谢组学研究的可靠平台[10-12]。因此本研究基于GC-MS代谢组学技术筛选出凤冈锌硒茶影响大鼠机体代谢调节的关键代谢物,进一步通过通路富集分析揭示凤冈锌硒茶影响大鼠机体代谢调节的通路,从而初步揭示凤冈锌硒茶影响大鼠机体代谢调节的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

SD大鼠 SPF级,雄性,体重180～220 g,共36只,合格证号为:SCXK(渝)2012-0005,第三军医大学医学实验动物中心;凤冈锌硒茶 贵州省凤冈县万壶缘锌硒茶业有限公司;十七碳酸、甲醇、甲氧胺盐酸盐 阿拉丁生化科技股份有限公司;吡啶 天津市科密欧化学试剂有限公司;N,O-双(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA) 西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;三甲基氯硅烷(TMCS) 上海晶纯生化科技股份有限公司;正庚烷 赛默飞世尔科技(中国)有限公司;肝素钠 北京索莱宝科技有限公司;总超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)检测试剂盒、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)检测试剂盒 碧云天生物技术研究所。

SG3300HE超声仪 上海冠特超声仪器有限公司;TGL16M台式高速冷冻离心机 长沙迈佳森仪器设备有限公司;DN-36A氮吹仪 上海乔枫事业有限公司;XW-80A涡旋混合仪 海门市其林贝尔仪器制造有限公司;101型电热鼓风干燥箱 北京中兴伟业仪器有限公司;ISQ-Trace1300气相色谱-质谱联用仪 赛默飞世尔科技公司;BX43+DP2b奥林巴斯光学显微镜 日本奥林巴斯公司。

1.2 实验方法

1.2.1 给茶样本的制备 称取凤冈锌硒茶200 g,剪碎,加入10倍量水,煎煮10 min,重复三次,过滤,合并滤液,减压浓缩至浓度为1 g/mL,2000 r/min离心10 min,0.22 μm微孔过滤后于-20 ℃保存备用。

1.2.2 实验分组及给茶处理 大鼠适应性饲养一周,随机分成3组,每组12只,其中对照组口服灌胃一蒸水(10 mL/kg/d);高剂量组口服灌胃凤冈锌硒茶,剂量为(1 g/kg/d);低剂量组口服灌胃凤冈锌硒茶,剂量为(0.5 g/kg/d)。各组均于每天下午四点给茶,连续6周,然后停止给茶,继续饲养3周。

分别在给茶前、给茶后的2、4和6周眼眶取血,于4 ℃冰箱静置30 min,随后低温离心10 min(4000 r/min),取离心后的血浆上清液于-20 ℃冰箱中保存待用。大鼠停茶并继续饲养3周后处死,解剖,肝脏灌注,于冰上取出肝脏,用预制冷的生理盐水洗净,用滤纸吸干表面水分,在电子天平上称重,称重后顺沿着肝小叶边缘切取两块肝小叶分别放入10%的甲醛固定液中,剩余的肝脏组织放到冻存管中于-80 ℃的冰箱中保存待用。

1.2.3 检测指标

1.2.3.1 肝脏形态学变化 取大鼠肝脏进行HE染色,观察大鼠肝脏组织形态学变化,如有无病变、细胞核大小有无变化等。

1.2.3.2 血浆氧化酶应激状态 取血浆,采用试剂盒检测大鼠血浆中SOD活性和MDA含量。

1.2.4 代谢组学分析

表1 大鼠血浆中SOD和MDA水平的变化(n=12,Mean±SD)Table 1 Change in SOD and MDA levels in plasma of rats(n=12,Mean±SD)

注：*表示P<0.05水平下差异显著，与对照组比较有统计学差异。

1.2.4.1 血浆样品预处理 取给茶后4周的大鼠血浆样品4 ℃解冻,4 ℃离心10 min(3000 r/min),取100 μL上清液,加内标(1 mg/mL十七碳酸)10 μL,加900 μL 4 ℃预冷的混合液(甲醇∶水=8∶1，V/V),涡旋混匀1 min,冰水浴超声10 min,4 ℃离心15 min(12000 r/min),取上清液200 μL,N2吹干,加30 μL 15 mg/mL甲氧胺盐酸盐吡啶溶液,70 ℃肟化1 h,再加入30 μL BSTFA(含1%的TMCS),70 ℃衍生化1 h。加90 μL正庚烷,涡旋混匀,4 ℃离心10 min(12000 r/min),取上清100 μL进样分析。

1.2.4.2 气相色谱-质谱进样分析条件 色谱条件:Agilent DB-5ms石英毛细柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)。升温程序:初始温度70 ℃,保持4 min,以速度为6 ℃/min增加到280 ℃,保持20 min。载气:氦气;载气流速:1 mL/min;进样量:1 μL;分流模式进样(3∶1)。

质谱条件:离子源温度:230 ℃;质量分析器温度150 ℃;进样口温度:280 ℃;离子源:EI,电子能量70 eV,全扫描35～600 m/z;溶剂延迟:5 min。

1.3 数据处理

数据采用Mean±SD进行表示,多组比较采用方差分析,两两比较采用t检验,P<0.05被认为差异有统计学差异。

代谢组学数据采用Xcalibur软件将数据转换为cdf格式,进一步采用R软件和Excel对数据进行数据提取、峰匹配、数据对齐及数据归一化。通过SIMCA-P14.1软件对数据进行多元统计分析,在经过无监督的PCA模型剔除异常值后,进一步构建OPLS-DA模型筛选出VIP>1和P<0.05的差异代谢物,最后通过结合KEGG、Metaboanalyst分析出相应的代谢通路。

2 结果与分析

2.1 肝脏组织形态学变化观察

图1为大鼠肝脏组织的病理HE切片图,可以明显看出凤冈锌硒茶高、低剂量组,与对照组的肝脏组织的形态学并无明显病理变化。

图1 大鼠肝脏病理形态学(×400)Fig.1 Morphological observation ofliver pathology in rats(×400)注:A:对照组;B:凤冈锌硒茶低剂量组;C:凤冈锌硒茶高剂量组。

2.2 血浆氧化酶应激状态结果

给茶后4周凤冈锌硒茶高、低剂量组的MDA含量和对照组相比显著下降(P<0.05),SOD活性各组间无显著差异。

2.3 代谢组学分析

2.3.1 GC-MS代谢组学分析 将各组大鼠血浆样品前处理后进行GC-MS分析,得到总离子流图,如图2所示,共鉴定出26个代谢物。

图2 对照组血浆样品的典型总离子流图Fig.2 Typical TIC chromatograms ofplasma samples from control groups

2.3.2 多元统计分析

2.3.2.1 PCA分析 采用SIMCA-P 14.1对样本数据进行PCA分析,如图3所示,对照组与给茶组分离不明显,虽然给茶后有变化,但变化不明显。

图3 对照组与给茶组大鼠血浆样品的PCA得分图Fig.3 PCA scores of plasma samples ofrats form control and tea groups 注:A空白组与给茶高剂量组比较;B表示空白组与给茶低剂量组比较。

2.3.2.2 OPLS-DA分析 为了更好的观察饮用凤冈锌硒茶对血浆代谢物的影响,本研究进一步通过构建OPLS-DA模型,如图4所示,模型的R2均大于0.5,如表2所示,说明模型的拟合准确性好。进一步对OPLS-DA模型进行200次置换验证,如图5所示,置换验证的R2与Q2均小于表2中模型的原始值,且Q2<0。说明构建的OPLS-DA模型稳健。在模型未过拟合的基础上,可以看出对照组与高、低剂量组的代谢轮廓存在一定的差异。

图4 对照组与给茶组大鼠血浆样品的OPLS-DA得分图Fig.4 OPLS-DA scores of plasma samples onrats of control and tea groups 注:A空白组与给茶高剂量组比较;B表示空白组与给茶低剂量组比较。

图5 OPLS-DA模型置换验证Fig.5 Permutation test of the OPLS-DA model注:A表示空白组与给茶高剂量组比较的置换验证(R2=0.805,Q2=-0.423);B表示空白组与给茶低剂量组大鼠比较的置换验证(R2=0.906,Q2=-0.443)。

表2 OPLS-DA模型的R2Y与Q2值Table 2 R2Y and Q2 values of the OPLS-DA model

2.3.3 差异代谢物的筛选 结合NIST标准库对总离子流图中的离子进行代谢物鉴定,共鉴定出匹配度≥80的代谢物25种,如表3所示。进一步通过SIMCA-P14.1进行分析,以变量重要性投影(VIP)>1及P<0.05,筛选出凤冈锌硒茶调节大鼠血浆的五种差异代谢物,分别为丁酸、L-脯氨酸、琥珀酸、肌醇、硬脂酸。同时得到五种差异代谢物在各组中的相对含量。如图6所示,其中给茶高剂量组中的L-脯氨酸,肌醇,琥珀酸的含量较对照组明显下降(P<0.05),丁酸、硬脂酸的含量明显升高(P<0.05),低剂量组仅升高了丁酸的含量(P<0.05)。

表3 大鼠血浆样品GC-MS分析的代谢物鉴定结果Table 3 The results of metabolite identification ofGC-MS analysis of rat plasma samples

续表

图6 大鼠血浆样本中五种差异代谢物的相对含量Fig.6 Relative content of five differential metabolites in rat plasma samples注:*表示差异显著P<0.05,**表示差异极显著P<0.01,与对照组比较。A～E分别表示L-脯氨酸、丁酸、琥珀酸、肌醇和硬脂酸。

2.3.4 代谢通路分析 对筛选出的5种差异代谢物经metaboanalyst通路富集分析,结果如图7所示,其中磷酸肌醇代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、三羧酸循环的impact值大于0.02,提示凤冈锌硒茶影响大鼠机体代谢调节的作用机制与磷酸肌醇代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、三羧酸循环密切相关。

图7 通路富集分析Fig.7 Path enrichment analysis注:A:磷酸肌醇代谢;B:精氨酸和脯氨酸代谢;C:三羧酸循环。

图8 凤冈锌硒茶影响大鼠机体代谢的代谢途径网络结构Fig.8 Structure of metabolism pathway networksaffecting rat body metabolism by Fenggang Zinc-Selenium Tea

3 讨论

凤冈锌硒茶茶叶中锌硒含量丰富,其中硒通常以硒代替胱氨酸的形式存在于氧化酶中,参与清除由人体内部新陈代谢产生的自由基。SOD是超氧化自由基的特异性清除酶,它能保护细胞免遭有氧代谢反应中产生的超氧离子的损伤,从而对机体起保护作用。MDA是脂质过氧化反应和脂质代谢产物之,当机体内MDA升高,SOD降低时,提示肝脏可能受到损伤[13-16]。本实验得到的结果显示给茶后4周凤冈锌硒茶高、低剂量组的MDA含量较对照组显著降低,而对照组SOD活性与凤冈锌硒茶高、低剂量组相比无明显变化,说明凤冈锌硒茶有一定的抗氧化作用,进一步表明饮茶后这种作用可能对肝脏具有一定的保护作用。这与文献报道的红茶对高脂饮食小鼠肝脏具有保护作用及绿茶提取物对四氯化碳致小鼠急性肝损伤具有护作用一致[17-18],同时在病理形态学方面发现,饮茶对肝脏无明显损伤发现,也进一步证明了其具有良好的安全性。

在给茶后4周的大鼠血浆中的MDA含量发生变化后,本研究对此时间点的血浆样品进行代谢组学分析,经OPLS-DA分析,发现给茶后,大鼠血浆代谢轮廓发生了显著变化,并筛选出凤冈锌硒茶影响机体的五个差异代谢物,包括丁酸、L-脯氨酸、琥珀酸、肌醇、硬脂酸,涉及到机体的磷酸肌醇代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、三羧酸循环,提示凤冈锌硒茶可能通过以上代谢物及途径发挥整体调节作用,为了更清晰的表征本作用,本研究整合上述差异代谢物及其关联的代谢通路,从网络角度揭示凤冈锌硒茶对大鼠机体的综合调节机制,如图8所示。

肌醇是人体细胞生长的一种必需物质,具有促进组织中脂肪代谢、降低血脂、参与体内新陈活动、促进细胞生长等[19-20]。有文献报道的衰老模型大鼠中肌醇含量出现升高,在给予琼玉膏干预后降低了衰老模型大鼠中升高的肌醇[21],本研究结果显示在给予大鼠凤冈锌硒茶后体内肌醇含量较对照组显著下降(P<0.05),肌醇含量的下降可能是凤冈锌硒茶作用后使其参与了抑制过氧化产物MDA的增加,这与文献报道肌醇具有抑制脂质过氧化,降低MDA含量一致[22]。肌醇还可参与下游通路脂肪酸生物合成、丁酸代谢等,进一步分析网络发现,下游通路脂肪酸生物合成、丁酸代谢中硬脂酸和丁酸含量显著升高,进一步印证了凤冈锌硒茶可能通过调节磷酸肌醇代谢中肌醇参与下游通路丁酸代谢,从而使大鼠机体内丁酸含量升高,促进大鼠机体的新陈代谢。此外体内丁酸含量升高会抑制肠腔肠上皮细胞增殖,并促进其凋亡,从而达到新陈代谢的目的[23-24],提示凤冈锌硒茶可能具有改善肠道菌群的作用。硬脂酸为长链脂肪酸,其具有一定的抗炎症和抗氧化应激作用,适量摄入可减轻胆汁阻塞引起的肝损伤[25-26],研究发现给茶后机体内硬脂酸含量升高,揭示凤冈锌硒茶通过影响脂肪酸代谢使硬脂酸参与抑制过氧化物MDA的增加。脯氨酸在机体应激状态胁迫下会升高[27],喝茶可能使机体处于更稳定状态,所以使得脯氨酸含量降低,从侧面来讲凤冈锌硒茶增强了机体的抗应激能力。琥珀酸是TCA的代谢产物,琥珀酸脱氢酶活性降低及基因突变可引起琥珀酸含量升高,促进肿瘤发生和发展[28-29],本研究发现凤冈锌硒茶可降低血浆中琥珀酸的含量,提示凤冈锌硒茶可能具有一定的防癌作用。

4 结论

基于GC-MS代谢组学技术研究凤冈锌硒茶对正常大鼠的整体代谢规律,筛选出了差异代谢物丁酸、L-脯氨酸、琥珀酸、肌醇和硬脂酸,初步揭示了凤冈锌硒茶通过磷酸肌醇代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、三羧酸循环等代谢途径影响大鼠机体代谢。为今后凤冈锌硒茶的进一步研究提供了一定的理论依据,此外还对凤冈锌硒茶新产品的开发具有重要意义。但本文属于非靶向代谢组学研究,研究得到的差异代谢物仍需进一步验证。