镜检、抗原检测和核酸检测方法在疟疾诊断中的应用比较

王加志,李希尚,尹授钦,王兴娟,杨东海,李新和

及时准确的诊断是防制疟疾的基础，按照疟疾诊断标准(WS 259-2015)，当前确诊疟疾病例的方法包括血涂片疟原虫病原学检查(镜检)、抗原检测(RDT)和核酸检测(PCR)等三种方法[1]。为分析三种检测方法在基层医疗单位中应用的效果，本文对2015-2018年腾冲市疟疾病例和疑似疟疾病例送检血样的检测结果进行分析比较，评价镜检、RDT和PCR 三种疟疾诊断方法的优缺点，为基层诊断疟疾选择适宜检测方法提供参考。

材料与方法

1资料来源

收集2015-2018年由腾冲市各医疗机构实验室送检的发热病人血涂片和抗凝血进行检测。

2试剂与仪器

核酸提取试剂盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit)购自德国QIAGEN公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。疟疾快速诊断卡(以下简称RDT)购自广州万孚生物技术股份有限公司。CX21FS1光学显微镜为日本Olympus公司产品。A-100PCR 仪和LG2020D凝胶成像系统为中国杭州朗基科学仪器有限公司产品。

3检测方法

3.1镜检制作厚、薄血涂片2张，置室温自然干燥，甲醇固定薄血膜后，用吉氏染液染色，由持WHO镜检水平一级证书的检验人员于光学显微镜下镜检，厚血膜在油镜下，检查100个视野以上或整个厚血膜未查见疟原虫判为阴性，血膜中查到疟原虫为阳性，并根据薄血膜上疟原虫形态特征进行虫种鉴定[2]。

3.2疟原虫抗原检测采用免疫层析技术检测特异性恶性疟原虫乳酸脱氢酶(pfLDH)和疟原虫乳酸脱氢酶(panLDH)，按试剂盒操作说明书进行，取患者外周血5μL，滴加于试剂卡加样孔A中，同时滴加4 滴裂解液于加样孔B中，15 min内观察结果。

3.3疟原虫核酸检测采用巢式PCR 方法，DNA提取按照试剂盒说明书操作。巢式PCR检测疟原虫种类的引物及其扩增产物长度见表1，恶性疟原虫205 bp、间日疟原虫120 bp、三日疟原虫141 bp、卵形疟原虫800 bp。设反应总体系20μL，巢式PCR 第1轮扩增体系包括PCR缓冲液2μL、10μmol/L 脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)1.6μL、10 μmol/L 引物rPLU5和rPLU6 各1.0μL、Taq 酶0.1μL、双蒸水13.3μL、DNA 模板1.0μL，混匀后进行PCR 反应。PCR 反应条件为:95℃3min，94℃1 min，60℃1 min，72℃2 min，共30个循环；72℃6 min。巢式PCR 第2轮扩增体系包括PCR缓冲液2 μL、10μmol/L dNTP1.6μL、10μmol/L 引物RVIV1和RVIV2 各0.8μL 或其他4 种疟原虫特异性上下游各0.8μL、Taq 酶0.1μL、双蒸水12.7μL、第1轮PCR 扩增产物2.0μL，混匀后进行PCR 反应。PCR 反应条件为:95℃3 min；94℃1 min，55℃1 min，72℃2 min，共30个循环；72℃6 min。同时设立空白和阳性对照，空白对照使用无菌水，阳性对照使用合成的疟原虫DNA片段。

4确诊病例

以镜检、RDT 和PCR 三种方法任意一种检测结果为阳性，且经云南省寄生虫病防治所复核、确认一致的阳性病例，定为确诊病例。

5统计学分析

采用Excel 2010、SPSS 17.0软件整理分析数据资料，计算灵敏度、特异度、假阴性率、假阳性率、符合率等指标。不同检测方法与确诊结果比较用Kappa检验。

结果

1检测样本数量及确诊结果

2015-2018年，疟疾送检样本共计610 份。每份样本经三种方法同时检测，判定为阴性样本295份(48.36%)，阳性样本315份(51.64%)。其中恶性疟67份(21.27%)、间日疟245份(77.78%)；三日疟1份，混合感染2份。见表2。

2三种疟疾检测方法的检测效果

结果显示，三种检测方法中，PCR 的灵敏度和阴性预测值最高、假阴性率最低。三种方法的特异度、假阳性率和阳性预测值相同。在总符合率方面，Kappa检验结果显示三种方法均与与确诊结果高度一致(Kappa=0.993、0.957、0.944，P均＜0.001)。其中，对间日疟、三日疟和混合感染检测的符合率，以PCR 最高，为100%(246/246)；镜检次之，为97.97%(241/246)，其中5例镜检阴性，PCR检测为间日疟；RDT 最低，为93.9%(231/246)，其中15例RDT 检测阴性，PCR 检测为间日疟14例、三日疟1例。但对恶性疟单一虫种检测的符合率，以RDT最高，为100%(67/67)，其中2例RDT 检测阳性，PCR 和镜检均为阴性；PCR 次之，为97.01%(65/67)；镜检最低，为88.06%(59/67)。三种检测方法的具体检测结果以及评价效果详见表3、表4。

表1巢式PCR 引物和扩增产物长度

表2腾冲市2015-2018年疟疾样本检测情况

讨论

不同方法检测结果表明，敏感性以PCR 最高，镜检次之，RDT 最低。对除恶性疟以外虫种的鉴定能力，以PCR 最高，镜检次之，RDT 最低；但对于恶性疟单一虫种的鉴定，则以RDT 最优。以PCR 为代表的分子检测技术是镜检、RDT 和PCR 等检测方法中敏感性最高的，其检测灵敏度达4.4个原虫/μL 血[3]，同时，PCR 方法在基因水平进行虫种的准确鉴定，也是特异性最高的检测方法。巢式PCR 用于疟疾的检测和虫种鉴定，有利于提高疟疾的检出率和准确性[4]，但由于成本高、操作较复杂、人员培训难、需特殊仪器及检测的快速性等方面受限制，在基层单位实际应用较难推广。血涂片染色后镜检一直被认为是疟疾诊断的“金标准”。目前，镜检仍是我国疟疾诊断的主要方法，其具有操作简便、敏感、价廉和可鉴别虫种等优点，但对检验人员的技术要求较高，易受主观因素影响，不同镜检人员可能会得出不一样的结果[5]，因此需要经验丰富的检验人员才能正确鉴定虫种，以避免漏诊和误诊。随着我国消除疟疾进程的推进[6]，基层镜检人员检测疟原虫的机会越来越少，因此想要维持较高的镜检能力和水平有较大的挑战。

本研究结果显示，RDT 的灵敏度为94.60%，特异度为100%，且与确诊结果的符合率高达97.21%，提示RDT 可以检出绝大部分疟疾阳性病例。对于RDT 检测恶性疟阳性、而PCR 和镜检均为阴性的病例，并不一定是假阳性。经重复检测排除操作或结果读取方法不当、试剂盒储存不当等因素外，可能是因为有些病例治疗后，尽管血中原虫被清除，但pfLDH仍会在患者体内残存一段时间[7]。因此，RDT 检测恶性疟原虫感染样本较PCR 和镜检的敏感性可能更高，与江莉等[8]研究相似。同时，RDT

表3三种检测方法与确诊病例的检测结果比较

表4三种检测方法的评价指标结果

检测操作简便，即使非专业人员按照说明书也可进行操作，15 min内观察结果，结果读取快速准确，不需要特殊仪器设备，成本亦较低，基层医疗卫生单位使用，可有效提高基层疟疾诊断能力[9]，因此适宜现场和基层人员使用[10]。但需注意不同生产厂家生产的RDT 质量可能不同，其敏感性和特异性亦有较大差异，本研究仅选用了广州万孚的试剂盒，未与其他检测试剂盒相对照，RDT 检测结果仅代表此试剂盒的检测结果。