蓝氏贾第鞭毛虫末端结合蛋白1基因的克隆与原核表达

李汶霖,王鸿斌,李淑凝,王洋∗,李志敏,沈海娥,刘红宁,李幽美,赵旭安

1995年，Kohler S等通过酵母双杂交技术筛选到一个与结肠腺瘤状息肉蛋白(Aleriournatious polysis coli，APC)相互作用的蛋白质，由于该蛋白质是与APC的羧基端相互作用，因此被命名为末端结合蛋白1(End-binding protein 1，EB1)[1，2]。EB1在进化上非常保守，目前为止，在细菌、真菌、动物、植物中都鉴定出EB1的同源蛋白。EB1蛋白是一种重要的微管结合蛋白，其N端具有CH结构域，负责介导与微管的相互作用；C端是包含有EBH结构域的卷曲螺旋结构域，负责介导EB1的二聚化，并介导EB1与其他蛋白的相互作用；中间无定型结构的连接区将EB1的N端和C端连接起来。EB1对于微管的动态性调节具有重要的作用，并进而参与微管介导的多种细胞活动，如细胞极化、细胞运动、细胞有丝分裂等[3-6]。蓝氏贾第鞭毛虫(Giardialambia，简称贾第虫)是一种世界性分布的条件致病性原生动物，能够寄生于人和多种哺乳动物的小肠和胆囊引起以腹泻、腹痛和吸收不良为主要表现的贾第虫病[7]。贾第虫被认为是最原始的真核生物之一，具有简单的遗传背景，非常适合用于保守基因的功能研究[8]。在前期实验中[9，10]，我们通过酵母双杂交发现贾第虫EB1(gEB1)蛋白能与贾第虫的特有骨架蛋白成分-α贾第素成员发生相互作用。为了更好的研究其相互作用机制，本研究拟从贾第虫基因组中克隆geb1基因，并在大肠杆菌中进行表达，表达产物将为gEB1抗体的制备和功能研究提供材料[11]。

材料与方法

1材料

C2株贾第虫、大肠杆菌菌株E.coliRosetta(DE3)、E.coliTOP10、原核表达质粒pET-28α(+)均由本实验室保存；限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ、Pyrobest DNA聚合酶购自大连宝生物公司；DNA片段凝胶回收试剂盒、质粒小量快速提取试剂盒、T4 DNA连接酶和DAB显色试剂盒购自天根生化科技有限公司；兔源抗His单克隆抗体、HRP 标记的羊抗兔IgG 抗体购自北京康为世纪生物科技有限公司；引物合成及测序工作由上海生工生物技术有限公司完成。

2方法

2.1 C2 株贾第虫滋养体的培养将液氮内冻存的C2 株贾第虫复苏，转移到含改良TY-S-33培养基玻璃试管中，于37℃恒温箱培养。3 d后待虫体长满管壁，用冰浴法传代。将一支管壁长满滋养体的试管冰浴10 min取出，在双手掌间多次滚搓培养管，使贴壁生长的虫体完全自管壁脱落，吸取虫体培养液无菌条件下平均分装成三管，37℃培养，2 ～3 d可长满管壁。于倒置显微镜下观察细胞生长状况。选取传代两次、生长旺盛的对数期虫体，离心收集虫体团块。

2.2 PCR 扩增geb1基因片段使用DNA Kit试剂盒，按说明书提取C2型蓝氏贾第虫全基因组DNA。

根据GenBank上WB型贾第虫eb1基因(XM_

001706021.1)序列设计1对引物，P1(上游引物):5’-CATGCCATGG GCATGGCGCCGGTAAAAGCAC-3’和P2(下游引物):5’-CCGCTCGAGCTGATGATACTCCGCATACAGAATATC-3’，上下游引物分别含有NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点(下划线部分)。以贾第虫DNA为模板，P1、P2为引物，PCR 扩增目的序列，反应条件为:94℃预变性5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃90 s，共30个循环；72℃延伸10 min。PCR 产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，DNA胶回收试剂盒回收目的片段，回收产物经琼脂糖凝胶电泳估浓度。

2.3 gEB1原核表达重组载体的构建胶回收产物和pET-28α(+)载体分别经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切，37℃4 h，酶切产物胶回收后琼脂糖电泳估浓度。酶切回收后的目的基因和pET-28α(+)载体按摩尔比4∶1混合，16℃连接反应4 h。连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞，通过卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆，挑取阳性单克隆菌落摇菌提质粒后双酶切鉴定。

2.4 gEB1贾第素重组蛋白的诱导表达和鉴定将鉴定正确的质粒转化E.coliRosetta(DE3)，涂卡那霉素和氯霉素双抗平板，挑取阳性单菌落于含双抗的液体LB培养基中37℃震荡培养过夜按1%的接种量转接于3 mL 新鲜双抗LB培养基中，剩余菌液提取质粒并送检测序，测序正确者进行诱导表达，确保构建的质粒无碱基突变。当OD600达到0.4 ～0.6时加入0.1 mM终浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)于30℃诱导表达5 h。收集菌液离心，用200μL 无菌水和等体积2×SDS上样缓冲液重悬，煮沸5 min后离心，取20μL 上清行SDS-PAGE。电泳后一部分条带用考马斯亮蓝染色观察，一部分经湿转法l50 mA 1.5 h电转移至NC膜用于Western blot 鉴定。转完后的NC膜脱脂奶室温封闭2 h，以抗His-Tag 兔源多克隆抗体(1∶1 000)为一抗，4℃孵育过夜，TBST 洗涤3次，加入HRP 标记的羊抗兔IgG(1∶5 000)室温反应l h，TBST 洗涤后经DAB显色，观察结果。

结果

1 geb1基因的PCR 扩增结果

提取C2株贾第虫全基因组DNA进行浓度的测定。微量核酸测定仪检测可见一单峰，OD260/OD280为1.822 8，说明样本纯度较高，浓度为414.266 1 ng/μL。以贾第虫基因组DNA 为模版克隆geb1基因编码区，PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，可见760 bp的特异性条带，与预期大小相符(图1)。

图1 geb1基因PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳分析

2重组质粒的酶切鉴定

目的基因经双酶切后与pET-28α(+)相连，连接产物转化E.ColiTOP10，阳性克隆提取质粒后经NcoI和XhoI双酶切鉴定，电泳分别可见约760 bp的geb1基因目的片段、约5 300 bp的载体pET-28α(+)两条电泳条带(图2)，与预期结果一致，将进一步测序验证正确的质粒命名为pET-28α(+)-gEB1。

图2 pET-28α(+)-gEB1表达载体的双酶切鉴定

3 geb1基因的诱导表达和鉴定

重组质粒pET-28α(+)-gEB1转化E. coliRosetta(DE3)，0.1 mM IPTG 诱导表达5 h，并将所得产物煮沸裂解进行SDS-PAGE实验，以未诱导的重组质粒转化菌作为对照，SDS-PAGE验证重组蛋白的表达结果(图3)。结果显示诱导菌在分子量29 kDa 处有出现一条明显的条带，而未诱导菌没有此条带，与预期相符合(图4)。Western blot 确认此条带确为gEB1-His Tag 融合蛋白。

图3 SDS-PAGE电泳鉴定IPTG 诱导融合蛋白表达情况

图4 geb1基因融合蛋白Western blot 分析

讨论

EB1蛋白是一种微管正极示踪蛋白(plus-end tracking proteins，+TIPs)，能够结合在微管正在生成的正末端，促进微管持续性生长。EB1蛋白家族与其它+TIPs的主要区别在于EB1能够自发的追踪生长微管的正末端而不依赖于任何其它蛋白质和分子，并且EB1可以通过与+TIPs的相互作用，发挥平台作用，将其它+TIPs募集到微管的正末端使其发挥各自的功能[12-14]。因此EB1蛋白在形成微管正末端复合物中具有核心作用，影响微管动态性。

贾第虫具有高度发达的细胞骨架系统，由微管、微丝和细胞骨架蛋白所构成，近年来的研究证实，贾第虫的细胞骨架蛋白与其感染和致病有着密切关系[15]。贾第素是一类特异性细胞骨架蛋白[16，17]，目前已将其分成α-贾第素、β-贾第素、γ-贾第素和δ-贾第素4 大家族，每一个成员的具体功能目前未知[18-20]。以往的研究显示，gEB1能够与γ-贾第素直接发生相互作用。我们通过酵母双杂交实验发现，gEB1与α-贾第素家族的成员也存在相互作用。通过鉴定gEB1蛋白与贾第素蛋白相互作用的机制和生物学意义去反推两种贾第素的具体功能或许是个有效的方法，为此我们克隆了geb1基因并进行了原核表达。

由于贾第虫没有内含子的原始特性，我们直接从贾第虫的基因组上克隆了gEB1的编码区，测序结果显示C2株贾第虫eb1基因序列与WB株相同，编码的gEB1蛋白由238个氨基酸残基组成，分子量大约是29kDa，略小于人类的EB1蛋白，具有明确分区的CH结构域和EBH结构域[21]。但gEB1蛋白序列与高等动物的同源蛋白的一级结构上存在较大的差异，因此市售的小鼠或者人类EB1蛋白抗体均不能和gEB1结合。为了进一步证明gEB1与α-贾第素成员的相互作用，制备gEB1特异性抗体成为当务之急，gEB1的原核表达为其抗体的制备提供了基础，贾第虫也可作为EB1蛋白功能研究的良好模式生物。