白藜芦醇对大肠杆菌诱导的大鼠膀胱粘膜损伤保护作用机制的研究

钱余,蔡茹,周恩谱,黄进宝,贡东卫

临床上各种原因引起的膀胱出口梗阻或神经源性膀胱等所致的尿潴留需留置导尿或膀胱造瘘处理，但长期导尿或膀胱造瘘，易继发革兰氏阴性细菌感染引起的膀胱急、慢性炎症损伤，临床处理非常棘手[1，2]。白藜芦醇(resveratrol，Res)广泛存在于葡萄、松树、虎杖及花生等天然植物中，化学成分为3，5，4-三羟基二苯乙烯，属于含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物，分子式C14H12O3，分子量228.25，为无色针状结晶，具有抗氧化、抗炎、抗癌、保护心血管以及保护神经系统等多种生理功效[3-5]。本实验通过向大鼠膀胱内植入导管，以大肠杆菌液灌注诱导大鼠膀胱粘膜感染损伤模型，采用白藜芦醇溶液灌胃给药，观察膀胱粘膜病理、氧化-抗氧化和细胞因子变化，探讨白藜芦醇对感染性大鼠膀胱粘膜损伤的保护作用及机制。

材料与方法

1材料

1.1实验动物雌性SD大鼠45只，个体质量(170±10)g，由上海中医药大学动物实验学部提供，动物生产许可证号为SCXK(沪)2009-0021，独立笼盒系统分笼饲养，室温20 ～25℃，相对湿度40%～60%，光照和黑暗每12 h改变1次，标准饲料，自由饮水、摄食，常规饲养观察1 w 无异常，体重差异无统计学意义(χ2=1.098，P＞0.05)后进行实验(实验经过动物保护和使用委员会批准)。

1.2药品和试剂膀胱灌注用DH5α大肠杆菌溶液(108-9CFU/100UL，由湖南中医药大学第一附属医院检验科提供)，白藜芦醇购自杭州瑞树生化有限公司(29700-22-9)。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、还原型谷胱甘肽(GSH)、一氧化氮(NO)和丙二醛(MDA)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10 及TNF-α 试剂盒均购自上海酶远生物科技有限公司。TGF-β1抗体购自英国Abcam 公司。

1.3主要仪器CR21GII超高速冷冻离心机(日本日立公司)，Nanodrop2000 微量紫外分光光度计(美国Thermo Scientific公司)，EGll60组织包埋机、Rm2123组织切片机、CA5030组织染色机(德国Leica 公司)，CHK 型光学显微镜(Olympus公司)，BI-2000 图形图像分析系统(成都泰盟)，Model-680酶标仪(美国BIO-RAD公司)。

2方法

2.1动物分组、造模及给药随机分3组(每组15只):空白对照组、模型对照组、白藜芦醇实验组。除空白对照组外，其它两组大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液(10%水合氯醛按0.3 mL/100 g)0.3 ～

0.5 mL，麻醉后将大鼠固定，尿道口用70%乙醇和碘酊消毒，将直径1.4 mm的圆头软质金属导丝沾上无菌甘油后经尿道插入大鼠膀胱内，导丝另一端套上长6～8 mm、直径3 mm 聚乙烯材料的导管，再套上推管，顺着导丝用推管把导管推入膀胱并留置，拔出导丝，排空膀胱内尿液，针筒吸入0.5 ml大肠杆菌溶液由推管注入膀胱后拔出推管。同等条件饲养5 d后，实验组给予白藜芦醇40 mg/kg 每天灌胃1次，模型对照组以等量的生理盐水每日灌胃1次。

2.2指标检测10 d后处死各组大鼠，取膀胱组织于10%甲醛溶液中固定，按常规制作石蜡切片，HE染色，镜下观察病理变化。同时制作膀胱组织匀浆，严格按照试剂盒说明书要求进行检测。比色法检测SOD、CAT、GSH-Px 及MDA、NO活性含量，免疫组化(ELISA法)检测IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α的含量，Western blot 法检测TGF-β1蛋白表达。

2.3统计分析 采用SPSS 13.0 对实验数据进行分析，计量数据用均数±标准差(±s)，统计分析用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 SD大鼠膀胱组织病理形态的改变

镜下观察显示，模型对照组可见粘膜弥漫性充血、水肿，粘膜下层点状出血或瘀血，毛细血管扩张明显。炎性细胞浸润延伸至肌层，可见粘膜层与肌层的纤维组织母细胞、小圆形细胞和浆细胞的浸润。白藜芦醇实验组粘膜下炎性细胞浸润明显减少，纤维组织母细胞、小圆形细胞和浆细胞的浸润明显消退(图1)。

2白藜芦醇对大肠杆菌诱导的大鼠膀胱粘膜损伤的氧化应激影响

与空白对照组比较，模型对照组大鼠膀胱内SOD、CAT、GSH-Px 含量显著降低(t=18.79、9.09、20.87，P均＜0.01)，NO、MDA含量显著升高(t=5.16、5.68，P均＜0.01)；与模型对照组比较，白藜芦醇组大鼠膀胱SOD、CAT、GSH-Px 含量显著升高(t=13.62、6.3、18.38，P均＜0.01)，MDA、NO含量显著降低(t=4.4、2.78，P均＜0.01)(表1)。

3白藜芦醇对大肠杆菌诱导的膀胱粘膜损伤大鼠膀胱组织中各细胞因子的影响

与空白对照组比较，模型对照组大鼠膀胱内IL-1β、IL-8、TNF-α含量均显著升高(t=9.38、4.28、6.83，P均＜0.01)，而IL-6、IL-10含量变化不明显(t=0.56和0.97，P均＞0.05)；与模型对照组比较，白藜芦醇实验组IL-1β、IL-8、TNF-α炎性细胞因子均显著降低(t=7.22、3.02、4.80，P均＜0.01)，而抑炎细胞因子IL-6、IL-10明显升高，差异均有统计学意义(t=4.69、4.68，P均＜0.01)(表2)。

图1三组膀胱组织病理切片对比(HE:×150)

表2白藜芦醇对大肠杆菌诱导大鼠膀胱粘膜损伤膀胱组织中细胞因子含量比较(pg/mL)(X ±s，n=15)

4白藜芦醇对大肠杆菌诱导的大鼠膀胱粘膜损伤后大鼠膀胱组织中上皮-间质转化标记物TGF-β1表达的影响

大鼠膀胱组织中TGF-β1表达量，空白对照组为1.00±0.23，模型对照组为2.07±0.45，模型对照组大鼠膀胱组织中TGF-β1蛋白表达明显升高，差异有统计学意义(t=8.20，P＜0.01)；白藜芦醇实验组TGF-β1蛋白表达量为1.24±0.31，比模型对照组明显降低，差异有统计学意义(t=5.88，P＜0.01)。

讨 论

白藜芦醇是植物在潮湿环境下遭到真菌侵害时自身分泌的一种抗逆物质，在葡萄和浆果表皮中Res的含量较高。1963年Nonomura 等[6]提出Res是某些中草药治疗炎症、脂类代谢和心脏疾病的有效成分之一。近年来的研究发现，Res在抗氧化和诱除自由基以及影响花生四烯酸代谢方面[7，8]生物学效应明显，刘娅等[9]通过体外研究揭示Res对酪氨酸蛋白激酶(PTK)有抑制作用，提示它有免疫调节方面的重要作用。前期，我们通过大鼠前列腺炎模型，证实Res通过抑制巨噬细胞、淋巴细胞等的转录因子kB(NF-kB)活化，减少炎症过程中IL-1、IL-6和TNF-α等产生，对前列腺炎模型大鼠有明显的抗炎治疗作用[10]。

本文模拟临床留置导尿，向大鼠膀胱内植入异物导管+大肠杆菌灌注诱导，人为制造大鼠膀胱粘膜感染损伤模型，使其膀胱内壁氧化-抗氧化平衡态被破坏，随后以白藜芦醇进行治疗，观察治疗结果。实验结果显示，模型对照组大鼠感染大肠杆菌后，其膀胱SOD、CAT、GSH-Px 含量显著降低，NO、MDA含量显著升高，说明异物导管+大肠杆菌灌注有氧化应激反应，造成膀胱组织损伤。白藜芦醇组感染大鼠通过白藜芦醇液灌胃治疗后，与模型对照组比较其SOD、CAT、GSH-Px含量显著升高，NO、MDA含量显著降低，说明白藜芦醇清除氧自由基，恢复体内氧化-抗氧化动态平衡。

模型对照组中IL-1β、IL-8、TNF-α含量均显著高于空白对照组，表明在大鼠膀胱组织中，氧化应激损伤会进一步促使炎性细因子水平上升，在病理上表现粘膜弥漫性充血、水肿，粘膜下层有点状出血或瘀血，毛细血管明显扩张，炎细胞向肌层浸润，可见粘膜固有层和肌层有纤维组织母细胞、小圆形细胞和浆细胞；白藜芦醇实验组IL-1β、IL-8、TNF-α炎性细胞因子均明显降低，而抑炎细胞因子IL-6、IL-10 显著升高，表明提高了膀胱组织内IL-6、IL-10含量，抑制T 细胞、B细胞的增殖以及巨噬细胞活性，减少IL-1β、IL-8、TNF-α等炎性细胞因子生成，减弱炎细胞的黏附、渗出和浸润，从而减轻炎症反应，发挥了抗炎作用[10]，在病理表现上可见白藜芦醇组组织炎症情况明显好转。

在感染、炎症及氧化应激损伤等病理条件下，机体会激活多种细胞信号通路诱导上皮-间质转化通路，其中TGF-β1通路是重要的一员。TGF-β1本身也是一个强力的促纤维化因子，具调控成纤维细胞增殖功能，可使上皮细胞间失去极性并连接分离，同时间质细胞和成纤维细胞的大量产生，细胞外基质沉积，进而促进器官纤维化而丧失功能[11]。TGF-β1表达结果表明，与空白对照组比较，模型对照组表达显著升高，与模型对照组比较，白藜芦醇组显著降低，进一步说明了白藜芦醇对膀胱损伤后抗纤维化作用机制。

综上所述，本研究揭示白藜芦醇能显著抑制大肠杆菌诱导的大鼠膀胱组织中MDA、NO水平，提高SOD、GSHPx、CAT 活性抗氧化应激；降低促炎细胞因子1L-1β、IL-8、TNF-α的含量，提高抑炎细胞因子IL-6、IL-10 含量而抗炎；通过降低TGF-β1表达降低纤维化，从而起到保护膀胱粘膜作用，避免对膀胱组织伤害。故白藜芦醇有望作为潜在药物通过口服或膀胱灌注形式，治疗临床上各种原因引起需长期留置导尿或膀胱造瘘处理的尿潴留患者。