基于LF-NMR技术下3种猪肉水分含量预测模型的建立与比较

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(1.农业农村部肉品加工重点实验室,教育部肉品加工与质量控制重点实验室, 江苏省肉类生产与加工质量控制协同创新中心,南京农业大学食品科技学院,江苏南京 210095;2.南京农业大学理学院,江苏南京 210095)

水是肉与肉制品的主要组分之一,对肉品品质具有重要影响[1]。水分含量测定是判定肉品品质的重要指标,在肉制品加工原料的控制、肉品质量安全检测等方面具有广泛的应用。传统肉中水分含量的检测方法有干燥法、近红外光谱法等,但这些方法都存在一定缺陷,如干燥法耗时长、能耗高[2];近红外光谱法检测准确性不高等缺点[3]。

低场核磁共振技术(Low-field nuclear magnetic resonance,LF-NMR)是一种使用特定的脉冲序列(CPMG),通过测定样品中氢质子在横向xy平面上发生共振后由非平衡状态进入平衡状态的横向弛豫过程变化,进而分析样品中实际水分分布的技术。LF-NMR在畜禽肉品质检测方面已有广泛应用,主要根据T2弛豫时间来评价样品中水的分布状态[4-8]:T2b=1～10 ms为结合水,T21=30～60 ms为不易流动水;T22=100～400 ms为自由水。正是基于以上的这些特性,王欣等[9]、陈昊等[10]在猪肉水分检测方面进行了大量研究;同时,低场核磁共振技术在样品中实际水分含量检测方面也显示出了巨大的潜力,其检测速度快、操作简单、可实现无损检测等优点,近年来逐渐成为食品水分含量检测[11-12]、水分迁移[13-14]、结构分析[15-16]、鉴别[17]和品质鉴定[18-19]等多方面研究的热点,在功能性油脂[20]、蔬菜[21]等诸多食品中有了广泛的应用。但猪肉中弛豫特性与实际含水量的关系尚不明确。

针对以上问题,本实验以新鲜猪肉为实验材料,研究了LF-NMR弛豫特性与猪肉中水分含量的预测模型并进行验证,为实现肉中水分含量的快速检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

宰后36～48 h的猪肉背最长肌(剔除皮、筋膜、脂肪) 南京玄武区紫金城集贸市场。

MesoMR23型低场核磁分析实验仪器 配有25 mm直径线圈,上海纽迈电子科技有限公司;SQP电子天平 精度0.001 g，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;DGG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱 上海森信实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品准备 共采集宰后36～48 h的猪最长肌肉样119份,其中106份做校正集用于方程拟合,13份做预测集用于验证试验。用刀修整肉块边沿,并找出肌纤维的自然走向,用双片刀(间距1 cm)沿肌纤维的自然走向分切成多个1 cm厚的小块,再用陶瓷刀从1 cm厚的肉块中切成大小为1 cm×1 cm×2 cm的肉柱。在肉样的切取过程中应避免肉眼可见的结缔组织、血管以及其他缺陷。

1.2.2 LF-NMR弛豫时间测定 将肉柱放到特定的样品管中,在(32.00±0.01) ℃情况下用于低场核磁共振仪进行T2的测定,每个肉样平行测定三次,取平均值。

1.2.2.1 校正仪器的参数测试 选择FID序列,SW=100 kHz,质子共振频率SF=21 MHz,RFD=0.08 ms,Tw=2000 ms,模拟增益RG1=20 db,采样点数TD=1024,DRG1=3,PRG=1,累加次数NS=2。

1.2.2.2 仪器参数的设定 选择CPMG序列,SW=200 kHz,质子共振频率SF=21 MHz,RFD=0.08 ms,Tw=8000 ms,模拟增益RG1=15 db,采样点数TD=1024,DRG1=3,PRG=2,累加次数NS=8,DR=1,TE=0.3 ms,NECH=3200。

1.2.3 干燥法测定肉中水分的含量 参照国家标准《食品安全国家标准食品中水分的测定》(GB 5009.3-2016)[22]中的方法测定。

1.2.4 数据标准化处理 鉴于本研究的回波峰点数和样本数之间的数量级差别过大(大于2个数量级),所以在测得样本回波峰点数据之后,采用数据标准化处理方法以满足偏最小二乘回归及主成分回归探寻回波峰点数据与猪肉中真实水分含量的模型精度需求,防止出现模型拟合不合理的情况。标准化方法如下:设X=(x1,x2,…,xn)T是某一变量的一组观测,那么标准化处理即:

式(1)

1.2.5 最小二乘法(LSE) LSE是曲线拟合中估计回归参数的基本方法。该方法可以简便地求得未知的数据,并使得这些求得的数据与实际数据之间误差的平方和为最小。以两个变量为例,假定我们要研究两个变量(X,Y)之间的线性相关关系如式(2):

Y=a0+a1X

式(2)

通常可以得到一系列成对的数据(xi,yi),i=1,2,…,n。应用最小二乘法原理来估计未知参数,就是求满足式(3)的a0和a1:

式(3)

将目标函数式分别对a0和a1求偏倒数,并使这两个偏导数等于0即可求得参数估计值。

1.2.6 偏最小二乘回归(PLSR) 偏最小二乘法是一种数学优化技术,它通过最小化误差的平方和找到一组数据的最佳函数匹配。这种基于特征变量的回归方程在多元校正中得到了越来越多的应用。在PLSR建模之前需要优先确定最优主成分数。本研究中采用留一交叉验证确保样品都有同等的可能性参与训练从而提高拟合精度[23],并用PRESS确定主成分个数,采用均方根误差(RMSE)作为评价标准,按式(4)、(5)计算:

式(4)

式(5)

采用偏最小二乘法对校正集样品进行训练后建立PSLR校正模型,并用预测集样本进行测试。

1.2.7 主成分回归法(PCR) PCR是一种基于主成分分析(PCA)与多元线性回归的拟合方法。核心原理是以3200个回波数据矩阵X∈Rnxp(n为样本数,p为特征数),根据累积贡献率确定主成分数实现降维,从而使得多元线性回归方法能够适用。

PCA的主成分提取模型如下:

式(6)

式中,i表示索引各样本;Yij为第i个样本的第j个特征数值;Lij为第i个样本的第j个标准化特征的分量系数Fij(i=1,2,…,n,j=1,2,…,p)为目的提取出的主成分数据集的分量数值;Fi为第i个主成分。

Y=β0+β1F1+β2F2+…+βiFi

式(7)

根据均方差根误差(RMSE)判断拟合方法的准确性。

1.3 数据处理

用R Language对试验数据进行作图与统计分析,其中,统计结果以 “平均值±标准误”表示。

表1 不同含水率实验结果t检验分析表Table 1 t-text for means of the measurements of moisture content

注:同列不同字母表示差异显著(P<0.05)。

表2 猪肉水分化学值的统计结果Table 2 Statistical results of pork moisture chemical values

2 结果与分析

2.1 低场核磁共振测量结果

所有样品的T2谱如图1所示,应用纽迈核磁共振分析应用软件Ver4.0对CPMG曲线进行反演拟合得T2弛豫图像如图2所示。根据各峰横向弛豫最大值所对应的时间从小到大为T2b、T21和T22,依次表明该峰所含信息对应结合水、不易流动水和自由水;各峰峰面积所占总峰面积的比例依次称为P2b、P21、P22,分别对应结合水、不易流动水和自由水水分含量占肉中总水分含量的比例。

图1 猪肉样品连续分布驰豫衰减曲线Fig.1 Continuous distribution relaxation attenuation curve of pork samples

图2 猪肉样品的横向弛豫时间(T2)反演曲线Fig.2 Inversion curves of the transverse relaxation time(T2)for pork samples

2.2 弛豫特性分析

根据肉中水与其他物质的结合状态可以分为结合水、不易流动水和自由水。由于三种水的结合强度不同,所在受到磁场扰动之后呈现出不同的回波特性,可在T2弛豫时间的长短方面有所体现。将106份样品分为两组:高含水量组(含水率≥75%)与正常组(含水率<75%),53组高含水率组,53组正常组,其弛豫特性结果如表1所示。

横向弛豫时间T2分为T2b、T21和T22三个指标,分别对应结合水、不易流动水和自由水。高水分含量组的T21、T22、P2b、P21、P22与正常组有显著区别(P<0.05)。随着含水率的升高,T21、T22均显著增大,T2b则无显著性差异;通过进一步对比P2b、P21、P22等数据可以发现,水分含量的增大可以显著改变肉中各组水分的比例(P<0.05)。随着含水率的增加,不易流动水的峰面积占总峰面积的比例增大,自由水、结合水峰面积占总峰面积的比例显著减少(P<0.05)。

2.3 样品水分实际含量测定结果

表2所示为实验所选猪肉119个样本水分含量的参照值统计表,其中校正集106个样品用于最小二乘法,主成分回归法和偏最小二乘法的方程拟合,13个样品用于预测集以验证方程准确性。

2.4 水分实际含量测定结果

2.4.1 最小二乘法模型的建立与评价 使用核磁共振仪对肉样进行检测,将采集数据与肉样中水分含量(g)关联分析建立方程,以结合水、不易流动水、自由水对应的反演峰面积为Y值,以真实水分含量为X值,表3为肉中水分含量与核磁共振峰面积之间回归分析的结果,发现当Y值包含A21项的峰面积的时候,其对应拟合方程的系数与常数项都明显变化,这与肉中不易流动水占70%～80%的现状十分符合;同时比较发现,使用A2b+A21或A2b+A21+A22为Y值的拟合效果最好,决定系数分别为0.9339与0.927,所以综合考虑后选用A2b+A21所对应的Y=7538.4X-1102.9方程作为最终的相关方程。

表3 水分含量与核磁共振峰面积拟合方程Table 3 Equation for fitting moisture content and nuclear magnetic resonance peak area

为验证水分预测模型的精度与可靠性,另取13个肉样进行验证性试验。将样品放置在32 ℃条件下重复测量步骤收集峰面积的数据(A2b+A21)并演算出肉中水分含量(g),进而与烘干法所测相比较。如图3所示,方程为Y=1.018X-0.05,决定系数R2=0.9604,表明该方程具有一定的稳定性以及该方法预测精度较高。

图3 直接干燥法验证方程Fig.3 Verification equation of direct drying method

2.4.2 偏最小二乘法(PLS)回归模型的建立 偏最小二乘法回归模型以校正集106样本的3200个CPMG回波峰点数据作为自变量X,以猪肉水分的化学值为因变量Y,采用偏最小二乘法(PLS)对校正集的猪肉进行训练以建立X与Y的相关模型,应用留一交互验证法进行确定,如图4所示,当主成分数为3时,RMSECV值在相邻两点中值最小,故选择3作为模型的最佳主成分数以训练预测模型。运用模型对于预测集的13个数据进行预测,预测值与化学值的相关曲线如图5所示,横坐标为通过物理化学方法测得的水分含量在实际值,纵坐标为水分含量预测值,决定系数R2为0.969。

图4 交互验证均方根误差与主成分数的关系Fig.4 Correlation between PRESS and the number of principal component

图5 猪肉预测集样品水分的化学值与PLS方法获得的预测值关系Fig.5 Correlation between reference and predicted values by PLS for pork water content of calibration set and prediction set samples

2.4.3 主成分回归法(PCR) 如图6所示,为了避免主成分数n不足导致拟合效果不好,降维效果不理想,n过大导致出现过度拟合的问题,取n=5,此时随着n逐渐增大其累积贡献率到达85.31%,且基本不再增长,认为n+1时(n=6)累计贡献率变化可以忽略不计,此时5维矩阵已可较好的实现降维。运用模型对于预测集的13个数据进行预测,预测值与化学值的相关曲线如图7所示,横坐标为通过物理化学方法测得的水分含量在实际值,纵坐标为水分含量预测值,拟合曲线的决定系数R2为0.9409,具有较好的准确性与精确性。

图6 累积贡献率与主成分关系Fig.6 Relationship between cumulative contribution rate and principal components

2.4.4 模型评价 试验中所得核磁共振数据是一个3200维的数据矩阵,也可以反演后线性回归分析或者在原数据基础上直接进行多元拟合,这两类方法的分析结果(表4)可以看出,PLS都在校正集和预测集都显示出了更高的决定系数R2与更低的预测标准误差值RMSEP;传统的最小二乘法拟合的回归曲线(Y=7538.4X-1102.9)拟合效果相对较差,同时,PCR作为另一种多元拟合方法,其决定系数与预测标准误差值都不如最小二乘法,表明在该情形的猪肉实际水分拟合模型中,偏最小二乘法效果最好,其次是最小二乘法,最后是主成分回归法。

表4 最小二乘法、偏最小二乘法和主成分回归法预测猪肉水分的统计结果Table 4 Statistic of pork moistness content for Least squares,PLS and PCR

图7 猪肉预测集样品水分的化学值与PCR方法获得的预测值关系Fig.7 Correlation between reference and predicted values by PCR for pork water content of calibration set and prediction set samples

3 讨论

本试验根据国标法检测106份肉样的实际水分,参照《畜禽肉水分限量》[24]对不同含水率的肉样进行分类,发现肉样可分为53份正常肉组(含水率<75%)与53份高含水率组(含水率≥75%),证明市售猪肉含水率存在一定差异,根据本试验结果发现不同含水率组弛豫特性具有显著差异,这与王胜威等[25]关于注水、注胶肉的研究结果一致,同时,李健等[26]发现采用不同发酵床垫料优化棚舍结构对猪肉持水力影响显著,证明猪肉含水率的不同可能是由于猪养殖管理过程的饲料、环境差异性所造成;而刘萍等[27]进行猪肉含水率测量过程不确定因素分析发现重复测量对结果产生的影响最大,这也可能是猪肉含水率差异性的原因之一。

低场核磁共振通过测定恒定磁场中射频脉冲作用下氢原子的扰动规律,检测肉样中水分的实际含量与分布情况,在肉中实际水分的现实快速检测方面显现出巨大潜力。Bertram等[28]通过大量基础研究为低场核磁共振检测水分提供理论依据,庞之列等[29]通过探讨不同含水量猪肉的弛豫特性变化论证核磁共振快速检测的现实可行性,然而其研究并未能深入探讨弛豫特性与肉中实际含水量的模型关系。本试验通过对不同含水率下猪肉弛豫特性的差异性比较发现猪肉含水率对于T21、T22、P2b、P21和P22有显著影响(P<0.05)。高含水率组与正常组相比,T21、T22显著延迟(P<0.05),T2b无显著变化(P>0.05),说明含水率对于猪肉内部结合水自由度无显著影响(P>0.05),对于自由水与不易流动水有显著影响(P<0.05),T21显著增加(P<0.05)可能由于高水分含量组肉样猪在屠宰过程处于应激状态,使猪肉中肌原纤维的内环境发生改变,结构变得松散导致存在于肌原纤维内部的不流动水自由度增加,伴随有细胞膜通透性变化造成肌细胞内渗透压改变致使细胞内部空间膨胀,导致部分自由水与细胞结合能力进一步降低,从而体现为不易流动水与自由水弛豫时间显著延迟[7],T2b没有显著变化(P>0.05)主要是由于此部分水分子与蛋白质形成紧密结合,受到较强的束缚作用[30],从而使得弛豫时间没有显著变化,这与吴兆良等[31]的研究基本一致;P2b、P22显著低于正常组(P<0.05),而P21显著高于正常组(P<0.05)说明应激条件下,猪肉的组织结构可能存在损伤导致肉样保水性下降,如体细胞膨胀性破裂使得部分结合水摆脱原有束缚进而转换为不易流动水,这与盖圣美等[32]的结果相似。

建立模型是一种研究物质特性的良好方法,本实验中以标准误差值与决定系数作为模型评价指标,分别对最小二乘法、偏最小二乘法和主成分回归法进行模型评价。通过比较这三类方法的分析结果发现对于PLS方法而言,最小二乘法拟合的回归曲线拟合效果相对较差,可能是因为最小二乘法对于干扰信息过分敏感而PLSR模型采用了完整的猪肉样品弛豫信号,更能准确的代表整个样品的弛豫特性与具有更强的抗干扰能力[33]。同时,PCR作为另一种多元拟合方法,虽然充分利用3200个回波参数作为研究对象,但是在降维过程只解释85.31%数据导致并不能充分代表全部样本,这与高兴盛等[34]的研究结果相似;证明多元拟合校正方法可有效地减小了测量误差,能快速解决多维数据校正问题;曹晓兰等[35]采用OSC(orthonormal signalcorrection)预处理方法,通过选择特征波段作为输入变量可显著提高准确度,所以本文选用PLSR方法能较好地快速预测肉中的水分含量。与此同时,可以广泛地考虑不同多元拟合方法之间的优势互补,充分发各方法拟合特色,吉琳琳等[36]通过多元拟合中的人工神经网络方法(BP-ANN)对大米中水分进行快速测量,表明多元拟合技术在食品检测中新的应用前景;同时,张海云等[37]采用支持向量机技术(SVM)进行水分测量,发现在小样本、非线性、维数多和局部极小等数据情形下,SVM预测效果更好,表明在多元处理方面可以考虑PLSR降维后结合SVM进行模型预测效果良好[38]。

4 结论

本试验主要研究了肉中水分含量与低场核磁弛豫特性之间的关系并结合最小二乘法、偏最小二乘法和主成分回归法建立预测模型,发现猪肉中含水率对于T21、T22、P2b、P21和P22有显著差异(P<0.05),在此基础上采用偏最小二乘法(PLS)建立的模型具有可靠地预测结果,为以后猪肉水分快速检测研究与建立提供参考。