响应面法优化灵芝孢子粉高压脉冲电场破壁工艺

(山西农业大学工学院,山西太谷 030801)

灵芝[Ganodermalucidum(Ley.ex.Fr)Karst.]属于无褶菌目,灵芝科,灵芝属,别名灵芝草、仙草等,是一种食药兼用的大型真菌,且在我国分布广泛[1-2]。近年来,灵芝中的活性物质,如灵芝多糖、总三萜等均能够被有效分离出来[3-5]。这些生物活性物质主要富集在灵芝孢子中[6],具有抗肿瘤[7-8]、增强免疫[9-10]、改善睡眠[11]、抗抑郁[12]、消炎止血[13]、抗癌[14]等功效。

灵芝孢子壁是由支柱连接的双层结构[15],十分坚韧且耐酸耐碱,致使孢子内部的营养物质不能很好的溶出。当灵芝孢子粉进入人体后很难被胃液消化,从而阻碍了人体对营养物质的吸收。目前,灵芝孢子粉大多采用生物酶解法、化学法、物理法、机械法以及综合法的破壁工艺,其中生物酶解法和化学法处理过程较为耗时、破壁率较低,且破壁后不容易将加入的酶以及化学物质去除;物理法和机械法投资成本高,破壁后碎片太多[16]。

高压脉冲电场(High Vltage Pulsed Electrical Field)技术是一种非热力杀菌技术[17],它利用细胞膜电穿孔原理,短时间内对细胞壁和细胞膜造成破坏,致使细胞破壁[18]。Mohsen[19]综述了高压电场在食品工业中的应用,包括食品干燥、冷藏、冷冻、解冻、延长食品货架期和提取生物化合物等。我国高压脉冲电场更多地应用于细胞内物质的辅助提取[20-22]以及藻类的破壁[23]。高压脉冲电场破壁技术具有无污染,耗时短,产生的热能少等优点,且也不会产生过多碎片。为优化灵芝孢子粉破壁工艺,本试验以灵芝孢子粉为试验对象,以电场强度、脉冲个数和脉冲宽度为试验因子进行响应面优化试验,为破壁灵芝孢子粉的生产和高压脉冲电场技术的新领域应用提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

未破壁灵芝孢子粉 由山西农业大学食用菌中心提供；硫酸锌、无水乙醇、乙酸乙酯、高氯酸 均为分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司;葡萄糖、熊果酸 均为标准品，合肥博美生物科技有限公司;香草醛 分析纯，北京索莱宝科技有限公司。

ECM830型高压脉冲电场发生器 美国BTX仪器公司;CMM-15E型透反射金相显微镜 上海长方光学仪器有限公司;DHG-9023A型热风干燥箱 无锡三鑫精工电气设备有限公司;超声波清洗机 深圳市洁盟超声清洗机有限公司;BTX 610电极杯(物料添加区宽度规格为1 mm) 香港友诚生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 灵芝孢子粉试样处理及破壁率测定

1.2.1.1 灵芝孢子粉破壁工艺 工艺流程:灵芝孢子粉→配液→高压脉冲电场破壁→60 ℃干燥→待测。

取500 μL 0.05 g/mL灵芝孢子粉标准悬浮液定容于50 mL,混匀后取适量移入电极杯,设定相应的电场强度、脉冲个数和脉冲宽度,置于高压脉冲电场发生器中进行破壁试验,得到破壁灵芝孢子粉样液。破壁过程中,悬浮液温度有升高现象,经测定最高温度不超过40 ℃。

1.2.1.2 灵芝孢子粉破壁率标准曲线绘制 分别称取灵芝孢子粉0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10 g,使用0.07 g/mL硫酸锌定容于50 mL容量瓶,各取10 μL于400倍显微镜下观察并计数。测定得灵芝孢子粉标准曲线的回归方程为:y=989.31839x+0.7085,R2=0.9989。式中:y代表每个计数单位的孢子数(个);x代表未破壁灵芝孢子粉称样量(g)。

1.2.1.3 灵芝孢子粉破壁率测定 参照倪伟锋等人[24]改进的破壁率测定方法进行测定。经高压脉冲电场处理后的灵芝孢子粉样液60 ℃烘箱中烘干,于1.5 mL离心管4 ℃避光冷藏。称取0.10 g使用0.07 g/mL硫酸锌定容于50 mL容量瓶,取10 μL于血球计数板上,400倍显微镜下观察并记录完整孢子数。其中,完整孢子为未破壁孢子,除完整孢子外其余均视为已破壁孢子。破壁率按下式计算。

X(%)=(N1-N2)/N1×100

式中:X-灵芝孢子粉的破壁率(%);N1-从标准曲线查到的与待测样品相同质量的完整孢子个数;N2-计数得到的破壁孢子粉样品中完整孢子的个数。

1.2.2 单因素实验 影响灵芝孢子粉破壁率的主要因素有:电场强度、脉冲个数、脉冲宽度,分别考察它们对灵芝孢子粉破壁率的影响。

1.2.2.1 电场强度对灵芝孢子粉破壁率的影响 固定脉冲个数30000个,脉冲宽度50 μs,考察电场强度(10、15、20、25、30 kV/cm)对灵芝孢子粉破壁率的影响。

1.2.2.2 脉冲个数对灵芝孢子粉破壁率的影响 固定电场强度20 kV/cm,脉冲宽度50 μs,考察脉冲个数(10000、20000、30000、40000、50000个)对灵芝孢子粉破壁率的影响。

1.2.2.3 脉冲宽度对灵芝孢子粉破壁率的影响 固定电场强度20 kV/cm,脉冲个数30000个,考察脉冲宽度(10、30、50、70、90 μs)对灵芝孢子粉破壁率的影响。

1.2.3 响应面试验 在1.2.2单因素实验的基础上,根据单因素试验结果进行响应面试验设计。以灵芝孢子粉破壁率为响应值,以电场强度(A)、脉冲个数(B)以及脉冲宽度(C)为试验因子,共17个试验点,进行三因素三水平响应面试验。试验因子水平编码表见表1。

表1 灵芝孢子粉高压脉冲电场响应面试验因子水平编码表Table 1 The code table of factors and levels for high-voltage pulsed electric field response surface test of ganoderma spores powder

1.2.4 灵芝孢子粉活性物质溶出量测定

1.2.4.1 灵芝孢子粉粗多糖溶出量的测定 多糖溶出量按照NY/T1676-2008苯酚-硫酸法[25]进行测定。

以0.1 mg/mL葡萄糖溶液为标准品,以葡萄质量(mg)为横坐标,吸光值为纵坐标,得葡萄糖质量与吸光值的回归方程为:y=0.0106x+0.0008,R2=0.9980。称取破壁灵芝孢子粉0.25 g,经超声提取后离心,残渣洗入刻度试管,沸水浴2 h,待冷却至室温后,过滤后合并洗涤液,加水定容至刻度。测定时取1 mL待测液,加入蒸馏水、苯酚、浓硫酸,30 ℃水浴保温20 min,于490 nm处比色,测定其吸光值。样品中的粗多糖溶出量以质量分数(%)表示,结果按式(1)计算。

式(1)

式中:m1-从标准曲线上查得样品测定液中含葡萄糖量(μg);V1-样品定容体积(mL);V2-比色测定时所移取样品测定液的体积(mL);m2-样品质量(g);0.9-葡萄糖换算成葡聚糖的校正系数。

1.2.4.2 灵芝孢子粉总三萜溶出量的测定 总三萜溶出量参照陈冠州等[26]的方法进行测定。

0.1 mg/mL熊果酸为标准品,以熊果酸质量(mg)为横坐标,吸光值为纵坐标,得熊果酸质量与吸光值的回归方程为:y=0.0053x+0.0038,R2=0.9982。称取破壁灵芝孢子粉0.50 g,乙酸乙酯溶解,经超声提取后过滤,续滤液用乙酸乙酯定容于50 mL容量瓶。测定时取1 mL待测液,于100 ℃水浴蒸干,加入香草醛-冰乙酸溶液、高氯酸,65 ℃水浴保温45 min,转入冰浴后加入冰乙酸,15 min后于548 nm处比色,测定其吸光值。样品中的总三萜溶出量以质量分数(%)表示,结果按式(2)计算。

式(2)

式中:m1-从标准曲线上查得样品测定液中含熊果酸量(μg);V1-样品定容体积(mL);V2-比色测定时所移取样品测定液的体积(mL);m2-样品质量(g)。

1.2.5 数据处理与统计分析 每组单因素和响应面试验均重复3次取平均值,采用EXCEL 2003进行单因素试验数据处理,采用Design-Expert 10.0.7进行响应面试验设计与数据分析,采用Origin 2017软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 电场强度对灵芝孢子粉破壁率的影响 由图1可知,在灵芝孢子粉破壁过程中,随着电场强度的增加,破壁率呈现上升趋势。这可能是电场强度的增加产生的能量越大,对灵芝孢子粉细胞壁的破坏作用越大,使破壁率大有提高[27]。但当电场强度过大时,对细胞壁的破坏作用越大,但也可使部分糖苷键发生断裂,使细胞内活性物质发生降解[28]。另外,考虑到能耗的损失问题,在响应面试验中避免采用过高的电场强度,以20～30 kV/cm为宜。

图1 电场强度对灵芝孢子粉破壁率的影响Fig.1 Effect of electric field intensity on the rate of wall breaking

2.1.2 脉冲个数对灵芝孢子粉破壁率的影响 由图2可知,随着脉冲个数的增加,灵芝孢子粉破壁先呈现上升趋势;在脉冲个数达到40000个时,破壁率达到最大为70.2%±1.64%。随后,破壁率随着脉冲个数的增加,呈现下降趋势。增大脉冲个数,则脉冲作用时间延长,即脉冲效应累积,在脉冲个数达到40000个时,脉冲效应在灵芝孢子壁上累积达到最大,进而使破壁率达到最大。冯彩霞[29]在使用显微镜观察破壁灵芝孢子粉时发现,当脉冲个数过大时,灵芝孢子粉粘结成团,脉冲与单个灵芝孢子粉接触面积变小,进而导致破壁率降低。因此,在响应面试验中脉冲个数宜采30000～50000个为宜。

图2 脉冲个数对灵芝孢子粉破壁率的影响Fig.2 Effect of the number of pulses on the rate of wall breaking

2.1.3 脉冲宽度对灵芝孢子粉破壁率的影响 由图3可知,随着脉冲宽度的增加,灵芝孢子粉破壁率呈现快速上升趋势;脉冲宽度增加至50 μs时,灵芝孢子粉破壁率的增加逐渐趋于稳定;当脉冲宽度达到70 μs时,破壁率达到最大值,为68.7%±1.02%。周连宁等[23]进行了不同高压脉冲电场条件对小球藻破壁的影响研究,其结果表明,随着脉冲宽度的增大,小球藻的破壁率也呈现先增加后减少的趋势。脉冲宽度即单个脉冲作用于灵芝孢子粉细胞壁的时间,增加脉冲宽度,直接增加了单个脉冲对灵芝孢子粉细胞壁的破坏力,脉冲效应逐渐积累,最后达到了较高的破壁效果。因此,在响应面试验中脉冲宽度采用50～90 μs为宜。

图3 脉冲宽度对灵芝孢子粉破壁率的影响Fig.3 Effect of pulse width on the rate of wall breaking

2.2 灵芝孢子粉破壁工艺响应面优化试验

2.2.1 响应面试验结果 根据单因素试验结果,进行灵芝孢子粉高压脉冲电场破壁工艺响应面优化试验。试验结果见表2。

表3 方差分析与显著性检验Table 3 Analysis of variance and significance test

表2 灵芝孢子粉破壁工艺响应面试验结果Table 2 Response surface test results of wall breaking technology for ganoderma spores powder

2.2.2 模型建立与方差分析 对表2试验结果进行方差分析(表3),得到灵芝孢子粉破壁率回归方程:Y=64.06+6.14A+2.64B+4.03C+1.72AB+5.05AC-1.9BC-8.97A2-7.17B2-6.04C2。

通过比较P值可判断回归模型中各因素影响的显著程度。模型中因素AB、BC为不显著项(P>0.05),其余均为极显著项(P≤0.01)。各因素对灵芝孢子破壁效果从大到小依次为:电场强度、脉冲宽度、脉冲个数。

2.2.3 响应曲面分析 图4～图6可直观地反映电场强度、脉冲个数和脉冲宽度三试验因子对响应值破壁率的影响。在试验范围内,响应值破壁率先不同程度地增大,当响应值增大到最大值后,响应值破壁率又呈现不同程度地下降趋势。因此,在试验因子水平范围内,存在灵芝孢子粉高压脉冲电场的最大破壁率。

由图4响应曲面可知,灵芝孢子粉破壁率随着脉冲个数的增加而增加,趋于平缓后略有下降;灵芝孢子粉破壁率随着电场强度的增加快速增加至最大值,而后略有下降。由图5响应曲面可知,在较低的脉冲宽度范围内,灵芝孢子粉破壁率随着脉冲宽度的增加而迅速增加,之后随着脉冲宽度的继续增大,破壁率增加趋势变得平缓,但最高值与最低值之间变化幅度较大;灵芝孢子粉破壁率随着脉冲个数的增加呈现先增加后略有下降的趋势,但下降趋势较为平缓。

由图6响应曲面可知,随着脉冲宽度的增加,响应值破壁率呈现先增大后减小趋势,但最高值与最低值之间变化幅度较小;灵芝孢子粉破壁率随着电场强度的增加而逐步增加,当电场强度进一步增大时,灵芝孢子粉破壁率出现下降趋势。图6等高线图趋于椭圆形,表明电场强度与脉冲宽度的交互作用显著。其可能的原因是:电场强度越大,脉冲冲击到灵芝孢子壁的能量越大,进而引起胞壁的通透性增大,更易被击穿;脉冲个数是影响脉冲作用时间的主要因素,脉冲个数的增加表明脉冲作用总时间的延长。当电场强度与脉冲个数二者的破壁效应累加时,即相当于高压脉冲作用于通透性较大的细胞壁上,脉冲效应长时间累积后对孢壁造成破坏。因而,电场强度和脉冲个数的互作效应对灵芝孢子粉的破壁效果较为显著。

图4 电场强度和脉冲个数对灵芝孢子粉破壁率影响的响应曲面和等高线Fig.4 Response surface and contour line of the effect of electric field intensity and number of pulses on the rate of wall breaking

图5 脉冲个数和脉冲宽度对灵芝孢子粉破壁率影响的响应曲面和等高线Fig.5 Response surface and contour line of the influence of pulse number and pulse width on the rate of wall breaking

图6 电场强度和脉冲宽度对灵芝孢子粉破壁率影响的响应曲面和等高线Fig.6 Response surface and contour line of the effect of electric field intensity and pulse width on the rate of wall breaking

2.2.4 灵芝孢子粉破壁工艺的验证及对比试验 灵芝孢子粉高压脉冲电场破壁条件为:电场强度27.52 kV/cm,脉冲宽度80.31 μs,脉冲个数41761.11个,灵芝孢子粉破壁率为66.88%。考虑到仪器参数设置及现实因素,取电场强度25 kV/cm、脉冲宽度80 μs,脉冲个数40000个,在此条件下,重复3次试验得灵芝孢子粉破壁率平均值为66.74%±0.03%,与预测值相对误差小于3%,回归模型可靠。唐庆华等[30]使用低温研磨粉碎技术进行了峨眉山灵芝孢子破壁试验,结果表明灵芝孢子粉破壁率仅为46%,而本试验所使用的高压脉冲电场破壁技术将灵芝孢子粉破壁率提高了45%。

2.3 灵芝孢子粉活性物质溶出量分析

灵芝多糖和三萜是灵芝的主要生物活性物质[31-32],破壁前灵芝孢子粉粗多糖和总三萜含量分别为(0.88±0.02) g/100 g和(1.63±0.03) g/100 g,而经高压脉冲电场破壁后的灵芝孢子粉中,粗多糖和总三萜溶出量分别为(0.99±0.11) g/100 g和(1.79±0.03) g/100 g。试验结果表明:使用高压脉冲电场破壁工艺对灵芝孢子粉破壁后,孢内活性物质溶出量均有所提高。

3 结论

本试验利用高压脉冲电场对灵芝孢子粉进行了单因素破壁试验以及响应面优化试验。其结果为:电场强度、脉冲宽度、脉冲个数对灵芝孢子粉破壁试验结果表明,它们对破壁率的影响顺序为:电场强度>脉冲宽度>脉冲个数。在对响应面试验回归模型综合分析的基础上,得到灵芝孢子粉高压脉冲电场破壁的最佳工艺参数:电场强度25 kV/cm,脉冲宽度80 μs,脉冲个数40000个,灵芝孢子粉破壁率达到66.74%±0.03%。

高压脉冲电场破壁破壁后的灵芝孢子粉中粗多糖和总三萜溶出量分别为(0.99±0.11) g/100 g和(1.79±0.03) g/100 g。可见,该工艺既能提高灵芝孢子粉较高破壁率,也可避免因处理时间长对灵芝孢子粉内部活性物质(粗多糖以及总三萜)的破坏,可为灵芝孢子粉破壁以及高压脉冲电场的新领域应用提供参考。