加味阳和汤对膝骨关节炎大鼠模型基质金属蛋白酶调控及软骨保护作用研究*

★ 夏汉庭 曹端广 杨佛 李威 王书豪 刘璞 杨文龙 杨凤云**（.江西中医药大学研究生院 南昌 330004；.江西中医药大学附属医院 南昌 330006）

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是多种因素共同作用下导致关节软骨纤维化、皲裂、溃疡、脱失，从而导致关节疼痛、畸形、功能障碍等一系列临床症状的关节退行性疾病［1-2］。65 岁以上人群中OA 发生率50%，其中，8.1%为症状性KOA，且呈上升趋势［3-4］。目前西医除手术治疗外无特效治疗［5］，非甾体抗炎药仅可对症治疗且副作用大。关节软骨细胞凋亡、细胞外基质（extra cellular matrix，ECM）降解所致软骨退变是KOA病理过程的核心。临床研究显示，加味阳和汤能够改善KOA 症状并延缓软骨退变［6-7］。为进一步探究加味阳和汤的软骨保护机制，本研究拟观察加味阳和汤对碘乙酸（mono-iodoacetic acid，MIA）诱导KOA 大鼠模型中软骨保护作用及对IL-1β途径的诱导软骨细胞中基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）与II 型胶原酶（collagen II，Col2a）的调控作用。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 SPF 级雌性SD 大鼠12 只，体重（200±20）g，5 周龄，江西中医药大学大学动物实验科技中心，许可证号：SCXK（赣）2018-003。随机分组为空白组、模型组、加味阳和汤给药组。本动物实验步骤经江西中医药大学实验动物伦理委员会批准，并符合国家科学技术委员会《实验动物管理条例》之相关规定。

1.2 药物及仪器

1.2.1 药物与试剂 熟地15g、肉桂10g、麻黄10g、鹿角胶10g、木瓜8g、炮姜6g、白芥子10g、鸡血藤20g、汉防己10g、甘草3g，购自江西中医药大学附属医院中药房，鉴定符合2010 年《中华人民共和国药典》规定。由江西中医药大学中药固体制剂制造技术国家工程研究中心进行药品制备。生药经水煎、超滤浓缩、冷却、蒸干制为药粉，每100g生药得26g 药粉。分别按100，200，400，800，1000μg/mL 加入含10%胎牛血清DMEM 培养基用于后续实验。

碘乙酸（麦克林，I811707）、戊巴比妥钠（Sigma，57-33-0）、RIPA 试剂（Solarbio，R0020），PMSF（Sigma，93482-50ML-F），β-actin 小 鼠 单克 隆 抗 体（abcam，ab8226）、MMP-3 兔 单 克 隆抗体（abcam，ab52915）、MMP-9 兔单克隆抗体（abcam，ab76003），MMP-13 兔多克隆抗体（abcam，ab39012）一抗抗体，Col2a 兔单克隆抗体（abcam，ab188570），HRP 标记兔抗（Proteintech，SA00001-4）及HRP 标记小鼠抗（Proteintech，SA00001-1）二抗抗体，超敏ECL 发光液（Proteintech，B500024），DMEM 低 糖 培 养 基（Solarbio，31600），胎 牛 血清（Gibco，10099-141），0.25%胰 酶-EDTA 溶 液（Solarbio，T1320），II 型胶原酶（Solarbio，C8150），MTT（Solarbio，M8180），苏 木 素 染 液（Solarbio，G4441），伊红染液（Solarbio，G1108），番红O 染液（Solarbio，G2540），固绿染液（Solarbio，G1663）。

1.2.2 仪器 垂直电泳转印系统（Bio-rad，1658033），凝胶显像仪（Biorad，ChemiDoc MP），水平摇床（北京市六一仪器厂，WD-9405D），倒置显微镜（奥林巴斯，CX31），酶标仪（Tecan，SPARK），离心机（贝克曼，Optima）。

1.3 动物实验 结合Udo 等［8］已报道的方法，大鼠常规腹腔注射2% 戊巴比妥钠麻醉，右膝关节备皮，屈曲膝关节，消毒，关节腔注射含有1mg MIA的50μL 生理盐水溶液，空白组为50μL 生理盐水，1周1 次，连续4 周。见软组织明显肿胀且体表骨性标志不明显，即造模成功。饲养环境12h 昼夜循环，自由饮食及活动。第5 周起予以药物干预。加味阳和汤组予以5.32g/kg 加味阳和汤药粉溶解于3mL 10%DMSO 溶液灌胃，一日一次，连续8 周。空白组及模型组予以同等剂量10%DMSO 溶液。第12 周后，脱颈处死所有大鼠，取右下肢膝关节用于后续实验。

1.4 细胞实验

1.4.1 细胞提取及培养 取SPF 级3 周龄SD 大鼠，常规腹腔麻醉后脱颈处死，乙醇浸泡消毒后于超净台内取双膝关节软骨，PBS 洗3 次，剪碎，加入0.25%胰酶于37℃，5%CO2培养箱内消化1h 后终止消化。加入0.2%胶原酶置于37℃，5%CO2培养箱内消化4h。镜下见单个游离细胞后终止消化，150 目滤筛滤后移入25cm3培养瓶置于37℃，5%CO2培养箱内培养。汇合度达到80%时传代。结合文献方法［9］对第三代软骨细胞行甲苯胺蓝染色法鉴定并进行后续实验。

1.4.2 MTT 比色法筛选最佳干预条件 第三代软骨细胞以5×103/孔种植于96 孔板，贴壁后血清饥饿24h，梯度浓度加味阳和汤（100，200，400，800，1000μg/mL）加入血清培养基内分别干预24h，48h 及72h。另设不含细胞的调零孔及不含中药的对照孔。干预后加入10μL 0.5%MTT 溶液并置于培养箱内孵育4h，吸弃培养基，每孔加入150μL DMSO 溶液，中速摇晃15min。使用酶标仪在570nm 测定吸光度后依据下列公式计算细胞增殖度：（平均观察孔OD 值-平均调零孔OD 值）/（平均对照孔OD 值-平均调零孔OD 值）×100%。

1.4.3 细胞干预 第三代软骨细胞按5×106/孔种植于六孔板中，贴壁后即饥饿24h。分为溶媒组，IL-1β 组及梯度浓度加味阳和汤给药组。给药组予以梯度浓度加味阳和汤（100，200，400μg/mL）干预24h 后，给药组及IL-1β 组加入10ng/ml IL-1β诱导12h，收集细胞，进行后续检测。

1.5 Western Blot 检测MMP-3、MMP-9、MMP-13

及Col2a 按150μL/孔加入RIPA 溶液，刮取细胞后，超声3 次，5s/次，孵育30min，4℃ 14000RPM 离心离心20min，取上清。BCA 定量后加入Loading Buffer 煮沸变性，-20℃保存。上样前4℃离心，取上清上样至SDS-PAGE 凝胶，电泳，恒流转膜至PVDF 膜后，5% 脱脂奶粉溶液封闭1h，4℃孵育一抗，室温孵育二抗，TBST 洗膜4 次后滴加ECL显影液，显像。以内参条带灰度值为标准将目的蛋白灰度值归一化处理后比较相对趋势。

1.6 病理切片观察 大鼠膝关节标本置于4%多聚甲醛中固定72h，流水冲洗过夜，20%EDTA 脱钙21d 至针刺无阻力，梯度乙醇脱水后二甲苯透明，石蜡包埋，按5μm 切片。常规脱蜡，梯度乙醇复水，水洗。苏木精-伊红染色（hematoxylineosin staining，HE）染色切片浸于苏木精染色液中5min，水洗后浸于伊红染色液中5min，水洗，透明树胶封片。番红O-固绿（safranning O-Fast green）染色切片浸于固绿染液中5min，1%冰醋酸洗15s，番红O 染液5min，无水乙醇脱水，透明树胶封片。置于正置显微镜下观察并依据Lee 等［10］报道进行改良Mankin 法评分。

1.7 统计学方法 数据均采用均数±标准差形式表示，采用SPSS 19.0 软件进行t检验及ANOVA分析，P＜0.05 有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 动物实验过程中无大鼠死亡。空白组大鼠在假造模后注射处稍敏感，抗拒触摸、按压注射处，精神、活动、进食情况可。模型组及给药组均右下肢跛行，站立取食频次降低，精神不佳，活动减少。造模后可见膝关节软骨明显退变、溃疡、脱失，合并滑膜增厚，与KOA 软骨退变特点一致，表明造模成功（图1）。模型组及给药组均随干预进程出现不同程度恢复，其中给药组精神、活动情况改善优于模型组。

图1 造模组与空白组软骨退变对比

2.2 软骨细胞形态特征及染色鉴定

图2 镜下观察软骨及甲苯胺蓝染色结果

原代软骨细胞24h 左右即可贴壁，可见少量细胞呈多角形或不规则状缓慢生长，传代后增殖速度变快原代约需6d 可传至下一代，随后每代需3～4d。第四代后逐渐失去软骨细胞形态特征。甲苯胺蓝染色如图2 所示，细胞核呈深蓝，胞浆及间质呈淡蓝色，表明提取及培养所得为软骨细胞且纯度较好，可用于后续实验。

2.3 MTT 比色法筛选最佳干预条件 MTT 结果显 示，800μg/mL 及1000μg/mL 组 软 骨 细 胞 增 殖度 在24h，48h 及72h 条 件 下 均 低 于100，200，400μg/mL 组。各浓度组在培养48h 及72h 时，细胞增殖度均低于各自相应浓度组培养24h 的细胞增殖度。且48h 及72h 各浓度组内均出现不同程度软骨细胞生长抑制（P＜0.05）。因此，800μg/mL 及1000μg/mL 组及48h、72h 的培养时长不适用于后续实验，故本实验选取100，200，400μg/mL 加味阳和汤干预软骨细胞培养24h 为干预条件（图3）。

图3 MTT比色法筛选不同浓度加味阳和汤干预软骨细胞条件

2.4 MMP-3、MMP-9、MMP-13 及Col2a 蛋 白 表达水平比较 IL-1β 组MMP-3、MMP-9、MMP-13及Col2a 表达与空白组均有显著差异（P＜0.001）。100，200，400μg/mL 加味阳和汤干预后显示，加味阳和汤干预24h 能降低软骨细胞内MMP-3、MMP-9及MMP-13表达，提高Col2a蛋白表达。其中，400μg/mL 组相比100μg/mL 及200μg/mL 组干预效果更显著，差异有统计学意义（P＜0.05）（图4，表1）。

图4 不同浓度加味阳和汤对软骨细胞MMPs及Col2a表达的影响

表1 各组MMPs及Col2a指标表达情况（，n=3）

表1 各组MMPs及Col2a指标表达情况（，n=3）

注：与空白组相比，&P＜0.05，&P＜0.01，&P＜0.001；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与加味阳和汤高剂量组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。

组别 MMP-3 MMP-9 MMP-13 Col2a溶媒组 0.273±0.039 0.272±0.017 0.242±0.149 1.911±0.229模型组 2.127±0.288&&& 2.016±0.217&&& 2.504±0.543&&& 0.338±0.157&&&低剂量组 1.492±0.159**### 1.449±0.167***### 1.557±0.199**## 0.683±0.138##中剂量组 0.711±0.153*** 0.671±0.063*** 0.836±0.39*** 0.832±0.273*#高剂量组 0.475±0.193*** 0.445±0.041*** 0.242±0.186*** 1.337±0.311***

2.5 组织病理观察 空白组软骨面颜色鲜亮，平整，软骨细胞排列有序，无明显列席，胶原纤维走向齐整，无血管翳，未见波浪状断裂；模型组镜下可见软骨整体波浪状断裂，凹凸不平，各层软骨均可见软骨细胞坏死、排列紊乱，裂隙深达至中间层，基质可见沿胶原纤维走向撕裂，钙化软骨层纤维样变、血管翳、潮线增宽。加味阳和汤给药组软骨浅表层面基本光滑平整，未见明显深达中间层裂隙；可见基质层及钙化软骨层内有部分软骨细胞均匀排列，血管翳大多消失（图5 和表2）。

图5 加味阳和汤对软骨面的保护作用

表2 软骨组织病理切片改良Mankin评分（，n=4）

表2 软骨组织病理切片改良Mankin评分（，n=4）

注：与空白组相比，*P＜0.05；与模型组相比，#P＜0.05。

组别 溶媒组 模型组 给药组结构改变 0.21±0.06 3.93±0.30* 1.72±0.17#软骨细胞改变 0.22±0.11 2.37±0.39* 1.19±0.21#番红区改变 0.36±0.10 2.61±0.41* 1.29±0.37#潮线 0.14±0.06 0.67±0.21* 0.33±0.16#总分 0.92±0.14 9.55±1.21* 4.60±0.63#

3 讨论

KOA 可归于中医学之“骨痹”范畴。《素问·痹论》有云：“痹在骨则重……在于皮则寒。”这一论述高度的概括了痹病的临床表现。许鸿照教授认为，中老年肾失封藏，肾阳不足。肾阳虚则温煦失职，不能气化，阴寒内凝于肢体关节，鼓动血行不利而逐渐成瘀，气化失司则体内津液内聚为痰湿之邪，三者共成“寒、痰、瘀”实邪为标，实邪一成，不通则痛。故许鸿照教授在清代名方阳和汤的基础上，配伍舒筋活络之鸡血藤、木瓜、汉防己以治疗KOA 收获满意效果。方中熟地大补阴血，鹿角胶填精补髓，强筋壮骨；肉桂、炮姜温阳散寒解，麻黄开腠理以达表；白芥子祛经络及皮里膜外之痰；鸡血藤补血、活血、祛瘀，木瓜祛风除温，舒筋活络；汉防已利水消肿，止痛，甘草调和诸药。全方共奏温阳通络之效，故通则不痛矣。前期研究表明，加味阳和汤可延缓KOA 患者软骨退变［6］。我们推测该效果是由于下调基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）家族这一系列促软骨细胞外基质降解的关键基因的表达而产生的。

软骨细胞外基质（extracellular matrix，ECM）过度降解与软骨细胞凋亡形成恶性循环是KOA 病理过程的主要特点。软骨组织由软骨细胞及ECM共同组成，软骨细胞仅占不足10%，其余均为ECM及水。软骨组织的功能主要由软骨细胞分泌的ECM 中排列有序的网状结构提供。研究表明，软骨细胞主要功能是分泌ECM，同时ECM 又可反馈作用于软骨细胞，两者处于动态平衡［11］。ECM 由胶原、非胶原糖蛋白、氨基多糖与蛋白聚糖及弹性蛋白组成。其中，氨基多糖可与甲苯胺蓝反应，且与ECM 中氨基多糖含量变化而变化，故可用甲苯胺蓝染色鉴定软骨细胞。研究表明［12］，II 型胶原（collagen II，Col2a）是构成ECM 框架并提供抗压缩性能的标志性物质，可作为评价软骨细胞及ECM 完整性的关键指标。OA 发展时伴有ECM 中蛋白多糖浓度不断下降，Col2a 的降解导致网状结构纤维方向发生改变，也降低了对蛋白多糖的限制作用，共同导致ECM 降解，软骨逐渐退变，产生KOA 临床症状。

MMPs 是ECM 降解过程中的核心因素。MMPs与纤维蛋白溶酶共同作用下对几乎所有软骨ECM中蛋白多糖具有高裂解活性［13-14］。研究显示，阻断或降低MMP 家族的表达，可延缓关节软骨降解［15-16］。MMPs 不同亚型MMP 对各基质成分的降解能力有所差异，这些不同亚型在KOA 过程中即可各自作用，也可相互协作共同降解软骨［17］。其中较为重要的有是MMP-3、9 及13。MMP-3 除直接降解ECM 外，另可激活MMP-9、MMP-13等酶原产生级联放大效应，协同作用于ECM［18］。MMP-9 可破坏ECM，暴露抗原，碎裂胶原使得其更易为MMP-3 降解。MMP-3 和MMP-9 相互作用导致胶原网状结构失去其原有坚固特性，最终致使软骨退变［19］。MMP-13 在MMPs 中具有对II 型胶原最强的降解能力，在降解ECM 过程中处于关键地位。其降解速度是I 型胶原的5 倍，III 型胶原的6 倍［20］。

本实验结果表明，加味阳和汤可下调软骨细胞中异常增高的MMP-3、9、13，从而保护细胞外基质并上调Col2a 表达。同时动物实验病理切片结果表明，加味阳和汤可延缓软骨组织降解。本实验进一步证实了MMPs 是软骨降解的核心因素，并表明加味阳和汤通过下调MMPs 进而发挥软骨保护作用可能是其作用机制之一。这一发现为临床运用加味阳和汤治疗KOA 提供了理论基础，但其与上游信号通路的关系仍需进一步探究。