抗高原反应中草药添加剂的抗疲劳、耐低温、耐缺氧效果的研究

2020-04-01娄红军李金峰

中国工作犬业 2020年1期

娄红军都玉李金峰李刚

中国卫生部公布的《保健食品功能学评价程序和检测方法》中规定的抗疲劳、耐低温、耐缺氧作用的基本试验项目都是以动物试验研究评价的。因此我们进行功效特性评价时，严格控制影响试验结果准确性的主观因素和客观因素，保证评价结果的可靠性和准确性，并提高其试验结果的重现性。为此，我们根据犬的生理及现代中草药药理研究抗高原反应的科研成果，按中医理论组方，研制出纯中草药添加剂，主要成分包括：红景天、黄芪、当归、玫瑰花等;并根据各成份的用途、功能进行组方，科学设计；保证其质量同时，兼顾与维生素、微量元素、氨基酸等营养物质之间的协同性与颉颃性。经反复试验证明，该中草药添加剂具有抗疲劳、耐低温、耐缺氧的功能，能增强机体免疫功能、促进血液循环及新陈代谢的作用，能降低高原反应对犬的影响。为了验证其抗疲劳、耐低温、耐缺氧功能，并对其效果进行研究、评价，为该中草药添加剂的应用提供实验基础和研究依据,特做如下试验。

一、材料与方法

（一）主要试剂及仪器设备

1. 中草药添加剂

该中草药添加剂以红景天为主药，辅以黄芪、当归、枸杞、玫瑰花等几味中草药，按比例配伍、加工而成。

2. 试剂、仪器设备

表1 主要试剂与仪器设备

3.实验动物与饲养管理

选择健康、未曾交配、体况相近的ICR 小鼠，体重20g±2g，共320 只，其中雄性160 只、雌性160 只，由南京盛民科研动物养殖场提供。饲养条件达到实验动物建筑设施标准、实验动物饲育空气质量标准、环境噪声标准，室温温差24℃±5℃，相对湿度60%±20%，明/暗时间12h/12h。鼠粮、垫料由南京盛民科研动物养殖场提供。

4.实验设计

（1）受试小鼠的随机分组及灌胃设计

小鼠检疫后适应性喂养5d，给药前禁食8h，给药后禁食4h，但不限制饮水。将320 只小鼠随机分配到对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组。以警犬每日推荐摄入量（0.2g/kg）的5 倍、10 倍、20 倍作为低、中、高剂量，即低剂量组（1g·kg-1·d-1）、中剂量组（2g·kg-1·d-1）、高剂量组（4g·kg-1·d-1），对照组灌以等量生理盐水。每日定时灌胃，连续7d，排除因灌胃损伤意外死亡的小鼠后，进行各项实验。

（2）小鼠负重游泳实验

分别从对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组中各取10 只小鼠，选择严格遵循随机原则，雌雄各半。在末次给药30min 后称重，在每只小鼠背部固定5%体重的铅坠，松紧度适宜，立刻将各组小鼠分别置于游泳箱中游泳，控制水深不低于30cm、水温24℃±0.5℃、且使小鼠均无支持物攀附、持续游泳。立即按下秒表，观察各组小鼠游泳情况，准确记录小鼠从入水至力竭（小鼠头部完全沉入水中10s不起）的时间，即为小鼠负重游泳时间。

（3）小鼠运动后肝糖原、全血乳酸、血尿素氮含量实验

分别从对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组中各取10 只小鼠，选择严格遵循随机原则，雌雄各半。在末次给药30min 后，立刻将各组别小鼠分别置于游泳箱中无负荷游泳，控制水深不低于30cm、水温24℃±0.5℃、且使小鼠均无支持物攀附。准确计时使小鼠游泳90min 后取出，立即进行眼球采血，装入混有抗凝剂（肝素钠）的离心管中。取血后脱颈椎处死，剖解小鼠后取新鲜肝脏。按照试剂盒说明书测定样本肝糖原、血LD、BUN 水平。

（4）小鼠低温存活时间实验

分别从对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组中各取10 只小鼠，选择严格遵循随机原则，雌雄各半。在末次给药30min 后，立刻将所有小鼠混装于铁丝笼中并置于-20℃冰箱中，20 min 后每隔1min 观察小鼠存活情况，记录各组小鼠死亡数量。

（5）小鼠常压耐缺氧存活时间实验

分别从对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组中各取10 只小鼠，选择严格遵循随机原则，雌雄各半。在末次给药30min 后，立刻将每只小鼠分别置于装有25g 碱石灰（干燥剂）的250mL 广口瓶中，并用膏状白凡士林完全封闭瓶口。观察并记录各组小鼠状况，准确记录小鼠死亡（心跳呼吸完全停止）时间，即为小鼠常压耐缺氧存活时间。

（6）小鼠急性脑缺血性缺氧存活时间实验

分别从对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组中各取10 只小鼠，选择严格遵循随机原则，雌雄各半。在末次给药30min 后，将小鼠乙醚麻醉，用手术剪立刻从小鼠双耳连线处断头处死，准确记录小鼠自断头至张口喘气完全停止的时间，即为小鼠急性脑缺血性缺氧存活时间。

（7）小鼠亚硝酸钠中毒后存活时间的实验

分别从对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组中各取10 只小鼠，选择严格遵循随机原则，雌雄各半。在末次给药30min 后，称重，按照230mg/kg 的剂量逐只腹腔注射NaNO2，准确记录小鼠自注射至心跳呼吸停止的时间，即为小鼠NaNO2中毒存活时间。

5. 统计方法

实验数据录入EXCEL 软件进行初步处理，后采用SPSS24.0 统计软件进行t 检验。实验数据用“平均值±标准差表示。差异判断标准为：P＜0.05表示差异显著具有统计学意义，0.05＜P＜0.1 表示差异趋于显著。

二、结果

（一）中草药添加剂抗疲劳效果研究

1. 对负重游泳时间的影响

各组别小鼠负重游泳时间统计结果如表2 所示。总体来看，相比较空白对照组，3 个实验组小鼠负重游泳时间均显著延长，其中高剂量组延长率最高达73.60%，差异极显著（P＜0.01）。

注：＊表示实验组与对照组相比，差异显著（0.01＜P＜0.05）；＊＊表示实验组与对照组相比，差异极显著（P＜0.01）。

2. 对肝糖原值的影响

各组别小鼠运动后肝糖原含量统计结果如表3 所示。总体来看，3 个实验组肝糖原含量均明显高于空白对照组，其中中剂量组、高剂量组差异极显著（P＜0.01），肝糖原增长率分别达242.35%、198.43%。

表3 肝糖原含量（x±SD, n=10）

3. 对全血乳酸含量的影响

各组别小鼠运动后全血LD 含量统计结果如表4 所示。总体来看，3 个实验组LD 含量均明显低于空白对照组，且结果具有统计学意义（P＜0.05, P＜0.01），其中中剂量组降低率达32.56%，差异极显著（P＜0.01）。

表4 全血乳酸含量（x±SD, n=10）

4. 对血尿素氮含量的影响

各组别小鼠运动后血BUN 统计结果如表5 所示。总体来看，3 个实验组血BUN 含量均低于空白对照组，且结果具有统计学意义（P＜0.05, P＜0.01），其中低剂量组血BUN 含量最低，降低率为18.48%，且与对照组相比差异极显著（P＜0.01）。

表5 血尿素氮含量（x±SD, n=10）

（二）中草药添加剂耐低温效果研究

各组别小鼠低温存活时间统计结果如表6 所示。总体来看，相比较空白对照组，3 个实验组小鼠低温存活时间均明显延长，且结果具有统计学意义（P＜0.05, P＜0.01），其中低剂量组延长率最高达26.92%，差异极显著（P＜0.01）。

表6 低温存活时间（x±SD, n=10）

（三）中草药添加剂耐缺氧效果研究

1. 对小鼠常压耐缺氧存活时间的影响

常压缺氧主要对心肌、脑造成损伤后致死。在实验初期，各组小鼠均表现为在陌生环境中的好奇、试探；随着实验进行，可见小鼠被毛杂乱、呼吸迫促、抓挠瓶底、试图寻找出口，且排尿排粪量均有所增加；在实验末期，小鼠呼吸变慢变浅，被毛完全打湿、伏在瓶底几乎不动。统计各组别小鼠常压缺氧存活时间如表7所示。总体来看，相比较空白对照组，3 个红景天实验组小鼠缺氧存活时间均明显延长，其中中剂量组延长率最高达35.68%，差异极显著（P＜0.01），具有统计学意义。

表7 常压耐缺氧存活时间（x±SD, n=10）

2. 对小鼠急性脑缺血性缺氧存活时间的影响

各组别小鼠急性脑缺血性缺氧存活时间统计结果如表8 所示。总体来看，相比较空白对照组，3 个实验组小鼠脑缺血性缺氧存活时间均显著延长，且结果具有统计学意义（P＜0.05, P＜0.01），其中中剂量组延长率最高达47.63%，差异极显著（P＜0.01）。

表8 脑缺血性缺氧存活时间（x±SD, n=10）

3. 对小鼠亚硝酸钠中毒存活时间的影响

各组别小鼠NaNO2中毒存活时间统计结果如表9 所示。总体来看，相比较空白对照组，3 个实验组小鼠亚硝酸中毒存活时间均明显延长，其中中剂量组延长率最高达35.24 %，差异极显著（P＜0.01）。

表9 亚硝酸钠中毒存活时间（x±SD, n=10）

三、讨论

综合评定该中草药添加剂的抗疲劳、耐低温、耐缺氧作用统计分析结果如表10。

表10 抗高原反应中药方剂抗疲劳、耐低温、耐缺氧作用综合评定

（一）抗疲劳效果

疲劳的产生是一个极为复杂的过程，从能量代谢系统方面来看，“能源物质耗竭学说”现已被世界公认。该学说是指为满足运动能量需求，人体供能物质如脂肪、糖原等不断分解而储量骤减，短时间内得不到补充，机体正常能量来源的原有平衡被打破，作为3 大供能物质的组织蛋白被迫分解以补充能量缺口，便会代谢积累大量BUN 堆积在血液中。同时长时间运动使肌肉无氧酵解，堆积大量乳酸阻断了神经兴奋性传递，所以疲劳状态下身体原有的兴奋性和机能下降，肌肉收缩能力和耐力下降。在抗疲劳效果实验中，相比较空白对照组，3 个实验组负重游泳时间显著延长，运动后肝糖原值增高、血BUN 和LD 含量降低，4 项实验结果均显示阳性，可判定该中草药添加剂能够调节能量代谢、降低机体耗能、减轻乳酸堆积、缓解肌肉疲劳、增强运动耐力，具有较好的抗疲劳效果。

（二）耐低温效果

在耐低温效果实验中，相比较空白对照组，3 个实验组低温存活时间显著延长，结果阳性可判定该中草药添加剂能够加速机体对寒冷条件的适应，具有较好的抗寒冷、耐低温效果。

（三）耐缺氧效果

当小鼠断头后，尽管心脏供血停止，但脑部尚存的血液及营养物质可供短时间利用，维持短暂的呼吸功能；而NaNO2属于强氧化剂，当中毒剂量的NaNO2进入血液后，Fe2+转化Fe3+，血红蛋白运氧受阻，导致组织缺氧甚至死亡，皮肤表现为青紫色。在耐缺氧效果实验中，相比较空白对照组，3个实验组常压缺氧、脑缺血性缺氧、亚硝酸钠中毒存活时间均显著延长，4 项实验结果均显示阳性，可判定该中草药添加剂能够改善机体心肌、脑缺氧，减少应激损伤，具有较好的耐缺氧效果。