过表达miR-155对强直性脊柱炎滑膜细胞凋亡的影响及作用机制探讨

苟玉萧，吴霞，陈龙，汪佳利

强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一种免疫相关的慢性炎性关节疾病，主要临床表现为髋部、腰部、颈部等关节疼痛，具有较高的致畸性和致残性。AS发病多由感染、免疫遗传因素引起，患者滑膜关节、软骨关节、肌腱及韧带附着点被炎性细胞浸润，引起外周关节炎，严重影响生活质量[1]。研究发现，滑膜在关节的损伤破坏中发挥着重要作用，而AS的常见病理学改变是滑膜组织异常增生，形成滑膜炎，进而引起血管翳，并侵蚀破坏关节软骨，最终导致关节骨化强直[2]。随着年龄的增大或其他原因，滑膜组织缺少足够的营养物质，渗透性降低，这一过程极有可能导致滑膜细胞活性降低甚至死亡，从而影响滑膜组织的代谢，最终促使滑膜炎形成[3]。目前尚未完全清楚强直性脊柱炎的分子机制，大量研究发现或与滑膜细胞凋亡密切相关。MicroRNA(miRNA)是存在于真核生物中一类长度为18～25个核苷酸的非编码单链小分子RNA，其发夹结构是由Dicer酶加工的单链RNA前体(包含70～90个碱基)形成，能够与特定靶基因相结合进而参与调控转录后基因的表达[4]，其作用机制主要是直接结合在特定的靶信使RNA的3’非转录区，促使靶RNA发生降解或者翻译受到抑制，从而使目的基因表达受到影响。作为miRNA家族的重要成员之一，miR-155所在的非编码B细胞集合基因簇(BIC)第3个外显子位于人类21号染色体上[5]。目前miR-155在强直性脊柱炎中的作用研究逐渐成为热点，但其作用机制尚不十分明确。因此，现对强直性脊柱炎滑膜细胞进行miR-155过表达，并探讨其对细胞凋亡的影响机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)主要细胞：大肠杆菌菌株DH5α、人胚胎肾上皮细胞293T由遂宁市中心医院基础医学实验室保存；强直性脊柱炎滑膜细胞由该实验室制备并保存。miR-155模拟物(miR-155 mimic)及空白对照(mimic control)由上海吉玛生物技术公司代为合成；miR-155过表达慢病毒载体系统购自上海吉玛生物技术有限公司，由GV369、辅助包装质粒pHelper1.0和pHelper2.0 3个载体质粒构成。(2)试剂：DMEM、胎牛血清(FBS)、双抗、0.25%胰酶购自美国Gibico公司；限制性内切酶购自美国NEB公司；Taq聚合酶和T4 DNA连接酶购自日本TaKaRa公司。(3)仪器：双荧光素酶报告基因分析试剂盒、DNA Ladder购自美国Thermo公司； JC-1、PCR、反转录试剂盒及去内毒素小量提取质粒试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司； SD-001/SD-002动物细胞/组织总蛋白提取试剂盒购自英文特生物技术北京有限公司；脂质体Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；线粒体膜电位检测试剂盒购自美国R&D公司；Annexin V-APC/7-AAD双染细胞凋亡检测试剂盒KGA1023购自江苏凯基生物技术股份有限公司；HEK293T细胞、内参β-actin抗体、兔抗人FADD一抗、兔抗人Caspase-3、兔抗人Bcl-2、兔抗人Bax一抗和HRP标记的羊抗兔IgG二抗购自艾博抗(上海)贸易有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞制备及培养： 强直性脊柱炎滑膜细胞来自2018年5—8月在四川省遂宁市中心医院风湿免疫科行人工髋关节置换手术的强直性脊柱炎患者，均符合强直性脊柱炎诊断标准[6]。男女各4例，患者年龄32～55岁，中位数41.22岁。本研究经医院伦理委员会批准，患者及家属知情同意并签署知情同意书。

在无菌超净工作台内，将收集的病变滑膜组织取出，加D-Hanks液反复浸泡清洗干净，用灭菌手术剪刀将组织剪成1 mm×1 mm×1 mm大小碎块，加入适量在37℃水浴箱中预热的0.25%胰酶进行消化，肉眼观察组织无明显块状后，加适量FBS终止消化，并吸入离心管中离心 10 min，转至超净台，弃上清，加入含有10%FBS的DMEM培养基2 ml将细胞轻轻吹打开，吸至培养瓶中，再补加适量含有10%FBS的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中静置培养，2～3 d后用倒置显微镜观察细胞生长情况，隔天更换一次培养液，当细胞融合度达到80%～90%时进行传代培养。若制备细胞量大或暂时不使用，可加细胞冻存液后置于液氮中冻存，待用时取出复苏培养即可。

1.2.2 miR-155过表达载体构建及慢病毒收获：PCR方法扩增出目的片段，酶切并用凝胶回收试剂盒进行纯化回收。连接线性化慢病毒表达载体GV369，转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α中，涂布具有嘌呤霉素抗性的LB平板，挑取菌落进行鉴定，然后将阳性克隆扩大培养后提取质粒，测序正确的阳性克隆命名为GV369-miR-155。

将生长良好的293T细胞置于新的培养瓶中传代培养，培养条件为37℃、5%CO2，次日待细胞长至70%左右，弃掉原培养液，更换为无血清培养基继续放于培养箱2 h后备用。将构建的阳性质粒GV369-miR-155、辅助包装质粒Helper1.0和Helper2.0与转染试剂混合均匀，室温孵育，然后取适量混合液缓慢滴加至备用的293T细胞培养瓶中，轻轻晃动混匀后，放于37℃、5%CO2培养箱培养。同时设置GV369空载体转染对照，6 h后取出弃液，加入含10% FBS的DMEM培养基继续培养，48 h后吸取细胞培养瓶中营养液，在提前设置好的4℃离心机中离心10 min, 将上清液倒入滤器中过滤，然后转至超速离心管中，4℃超速离心2 h，PBS重悬沉淀即为包装好的慢病毒液，分装保存备用。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 miR-155慢病毒过表达稳定细胞系构建：首先筛选嘌呤霉素对强直性脊柱炎滑膜细胞的最低全部致死浓度，将对数生长期的强直性脊柱炎滑膜细胞铺于48孔细胞培养板，过夜培养后，每孔加入适量含有不同梯度浓度嘌呤霉素的10%FBS的DMEM培养基，每隔48 h换液，连续筛选1周，观察细胞生长状况，全部死亡的浓度即为最低筛选浓度。

复苏强直性脊柱炎滑膜细胞，待细胞生长状态处于对数生长期时铺于6孔板中，37℃、5%CO2培养过夜，次日细胞长至75%左右时，加入适量GV369-miR-155慢病毒液和空载体慢病毒液，感染强直性脊柱炎滑膜细胞8 h后换新培养液，继续培养2 d并在荧光显微镜下观察绿色荧光标签的表达。按照筛选嘌呤霉素最低致死剂量时的细胞密度，将上述细胞传代至6孔板，每隔48 h换为含最低致死剂量嘌呤霉素的10%FBS的DMEM培养基，连续筛选1周，挑取未被药物杀死的活细胞即为阳性细胞，进行扩大培养即为构建成功的稳定表达细胞系。分别将感染了GV369-miR-155及空载体慢病毒液的强直性脊柱炎滑膜细胞系分为GV369-miR-155-NP组和GV369-NP组，以未转染的滑膜细胞为空白组。

1.3.2 RT-qPCR法检测miR-155的表达效率：收集感染GV369-miR-155-NP和GV369-NP的细胞及空白组细胞，TRIzol试剂提取总RNA，用DNA/RNA测量仪测得RNA浓度。取符合要求的RNA样本，采用半定量RT-qPCR 法扩增miR-155 mRNA。按照PrimeScrip反转录试剂盒进行反转录成cDNA，采用SYBR Premix Ex Taq说明书配置PCR反应体系，反应条件为95℃预变性10 min，然后95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 10 s，40 个循环；95℃ 5 s，60℃ 1 min，95℃ 30 s。扩增结束后，产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳20 min，PUX Mix Marker 作为分子量参照物同时电泳，以β-actin为内参，引物序列见表1，用凝胶成像分析仪在紫外光下采集图像，采用Gepro 4.2软件分析目的基因与同一条带β-actin的光密度比值。

1.3.3 流式细胞术检测细胞凋亡：细胞分组处理同上，将各组细胞用不含EDTA的0.25%胰酶进行消化，吸至离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，用PBS洗2次，收集细胞。加入适量AnnexinV Binding Buffer重悬细胞，再分别加Annexin V-APC及7-AAD，室温避光孵育15 min。用Annexin V-APC/7-AAD双染细胞凋亡检测试剂盒对细胞双染，以避免与慢病毒表达的GFP荧光色谱的重叠，作用1 h内将制备好的样品置于流式细胞仪中检测分析。

1.3.4 荧光素酶报告基因分析：以人胚胎肾上皮细胞293T基因组DNA为模板，采用PCR扩增FasL的3'-非翻译区序列，构建至荧光素酶报告基因载体pGL3中，记为野生型pGL3-FasL-WT，同时构建突变型重组质粒pGL3-FasL-MUT。将HEK293T细胞按30%左右密度铺24孔板，将miR-155 mimic及mimic control分别与空载质粒、野生型pGL3-FasL-WT及突变型pGL3-FasL-MUT共转染至HEK293T细胞，分为对照组、野生组和突变组。转染后24 h，根据双荧光素酶测定试剂盒说明书检测荧光素酶活性。

1.3.5 Western-blot法检测Fas相关死亡结构域蛋白(FADD)、Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表达：细胞分组处理同上，将各组细胞采用SD-001/SD-002动物细胞/组织总蛋白提取试剂盒提取收集细胞中总蛋白，并用BCA蛋白定量检测试剂盒测定蛋白含量。将制备好的蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳后转至PVDF膜，加含有5% BSA的封闭液室温下封闭2 h。分别加用封闭液1∶1 000稀释的兔抗人FADD一抗、1∶500稀释的Caspase-3一抗、1∶1 000稀释的兔抗人Bcl-2及1∶2 000稀释的兔抗人Bax，置于4℃冰箱孵育过夜。次日，PBST洗膜3次，每次10 min，再加HRP标记的羊抗兔IgG二抗，室温孵育2 h，PBST洗膜，加ECL进行显色，暗室曝光拍照，并以β-actin作为内参蛋白。

表1 RT-qPCR引物序列

1.3.6 线粒体膜电位变化情况检测：细胞分组处理同上，参照JC-1线粒体膜电位检测试剂盒说明书，依次完成实验步骤，将各组细胞培养48 h后，在不同波长下观察细胞显色水平，其中红色荧光，激发波长490 nm，发射波长580 nm；绿色荧光，激发波长490 nm，发射波长520 nm 观察。使用计算机采集荧光图像，Image J软件重叠红绿荧光，将合成荧光的红、绿色荧光光密度比值作为膜电位表达水平。

2 结 果

2.1 miR-155稳定过表达强直性脊柱炎滑膜细胞系建立情况 感染慢病毒的强直性脊柱炎滑膜细胞，经过适宜浓度的嘌呤霉素筛选后，得到稳定转染的过表达miR-155细胞系GV369-miR-155-NP，以及空载体慢病毒细胞系GV369-NP。在荧光显微镜下观察，经慢病毒感染的过表达细胞系和空载体细胞系均出现绿色荧光，即慢病毒表达载体上的标签蛋白GFP表达，表明感染成功，而空白组细胞未见绿色荧光，见图1。

2.2 3组miR-155表达量比较 与空白组比较，GV369-miR-155-NP组中miR-155表达量明显升高(t=12.399，P=0.000)；GV369-NP组与空白组中miR-155表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)，构建的稳定细胞系能高效表达miR-155，见图2。

2.3 3组细胞凋亡率比较 与空白组比较，GV369-miR-155-NP组细胞凋亡率明显降低(t=12.612，P=0.000)；GV369-NP组和空白组比较，细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。

2.4 3组荧光素酶活性比较 双荧光素酶报告基因结果显示，与对照组比较，转染miR-155后，野生型FasL的荧光素酶活性被抑制(t=10.200，P=0.000)，突变型FasL的荧光素酶活性无明显变化(P>0.05)，见图4。

2.5 3组FADD、Caspase-3、Bax和Bcl-2 蛋白表达水平比较 与空白组比较，GV369-miR-155-NP组中FADD、Caspase-3及Bax的表达水平明显下降，而Bcl-2表达水平明显升高，差异均具有统计学意义(t=8.450，P=0.000；t=7.711，P=0.000；t=6.977，P=0.001；t=8.658，P=0.000)。GV369-NP组与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图5。

2.6 3组线粒体膜电位比较 转染后的细胞培养48 h 经JC-1处理后，空白组中细胞线粒体膜电位较低(红色荧光与绿色荧光比值较低)。与空白组比较，GV369-miR-155-NP组中细胞线粒体膜电位出现明显上升趋势，差异具有统计学意义(t=4.879，P=0.002)，空白组与GV369-NP组比较线粒体膜电位变化差异无统计学意义(P>0.05)，见图6。

3 讨 论

近年，强直性脊柱炎已成为一种常见高发性慢性病，不论是中老年人群还是青年人群均可发病。强直性脊柱炎可引起多种症状，髋部、腰部、颈部等关节疼痛为其主要临床表现[7]。目前，年龄、饮酒、过度劳累等被认为是导致强直性脊柱炎的外在因素。关于其发病的分子机制与传导通路也存在众多观点，炎性因子、遗传基因、氧化应激、NO诱导、MicroRNA等在强直性脊柱炎的发生发展中起到重要作用[8]，而NF-κB、PI3K/Akt、MAPK、Wnt/β-catenin、Notch等被认为是与该病相关的信号传导通路[9]。这些分子与信号通路相互影响，关系密切，在疾病发生过程中共同起作用。

众多研究表明，miR-155作为MicroRNA家族的重要成员，参与机体多项生理活动。miR-155在银屑病患者皮损中呈上调表达[10]，与炎性因子刺激有关。另外，miR-155在白血病中相当于一种癌基因，在多种实体肿瘤如结直肠癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌等高度表达，能够调控细胞的增殖、分化与凋亡等[11-14]。以往研究发现，miR-155在强直性脊柱炎滑膜细胞中表达量比正常滑膜细胞显著降低[15]。本研究中构建强直性脊柱炎滑膜细胞miR-155过表达细胞系，结果显示，与空白组比较，GV369-miR-155-NP组细胞凋亡率明显降低，这一结果证实miR-155可抑制强直性脊柱炎滑膜细胞发生凋亡，与既往的研究结果相符。

死亡受体与其配体相结合是细胞凋亡外源性通路的介导机制，强直性脊柱炎滑膜细胞凋亡与外源性通路FasL/Fas介导有关[16]。FasL/Fas凋亡通路的关键蛋白包含Caspase-3及FADD ，有报道称[17]，miR-155对该通路有调控作用，本研究采用双荧光素酶报告基因验证了miR-155与FasL具有靶向调控关系。进一步分析构建的稳定过表达miR-155细胞系中FADD和Caspase-3 蛋白表达情况，结果显示，与空白组比较，FADD和Caspase-3在GV369-miR-155-NP组中的表达水平明显下降。进一步证实miR-155对FADD和Caspase-3的表达起到抑制作用，与其能够抑制细胞凋亡的结果相符。

内源性途径引起的细胞凋亡首先发生于线粒体内，又称线粒体途径，该途径主要通过Bcl-2 家族蛋白进行调节，Bcl-2 家族蛋白主要包括抗凋亡成员Bcl-2、Bcl-W、Bcl-xL及Mcl-1等，促凋亡成员Bak、Bax及Bok等[18]。Bcl-2作为主要的抗凋亡成员在线粒体外膜发挥作用，可以维持膜结构的完整性[19]；Bax作为主要的促凋亡成员是通过破坏线粒体膜的完整性进而发挥作用的[20]。Bcl-2家族蛋白能够使线粒体膜的通透性发生精确的改变，也能诱导线粒体使其通透性转变孔道开放，而保护其外膜免受损伤，同时线粒体基质出现高渗状态，进一步膨胀造成外膜破裂，都能使膜间隙中的凋亡诱导因子、细胞色素C、促凋亡蛋白等物质进入胞质中，而后促凋亡蛋白可独立破坏核内染色质，也可通过激活Caspase，最终引起细胞凋亡[21]。本研究同时检测了抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax，GV369-miR-155-NP组中Bax的表达水平下降，而Bcl-2表达水平升高，与其他2组比较差异均具有统计学意义。该结果提示，miR-155在抑制强直性脊柱炎滑膜细胞凋亡中可能通过线粒体途径介导。为此进一步检测细胞线粒体膜电位的变化情况，结果GV369-miR-155-NP组细胞膜电位保持稳定，另外2组出现显著下降趋势，再次验证线粒体途径参与了miR-155抑制强直性脊柱炎滑膜细胞的凋亡。

综上，miR-155在强直性脊柱炎滑膜细胞凋亡中具有重要作用，可以通过靶向调控外源性FasL/Fas通路参与Caspase-3和FADD介导的细胞凋亡，此外，miR-155也可通过线粒体介导的途径抑制强直性脊柱炎滑膜细胞凋亡。此结果为以后进一步研究强直性脊柱炎提供可靠依据，同时对该病的功能恢复治疗具有重要意义。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

苟玉萧:设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；吴霞:提出研究思路，分析试验数据，论文审核;陈龙:实施研究过程，资料搜集整理，论文修改;汪佳利:课题设计