miR-141-3p和miR-22-3p在胰腺癌组织中的表达及其与临床病理特征和预后的关系

秦瑞峰，薛佳栋，霍浩然，张佳，袁增江

胰腺癌是临床恶性程度较高的恶性肿瘤，手术后生存时间较短，目前发病率逐年上升且有年轻化趋势，严重危害患者的生命安全[1-2]。如何改善胰腺癌患者的预后是目前临床研究的重点，但相关突破有限，分子靶向干预成为新思路。miRNA是一种不能编码蛋白质的单链RNA，在转录后水平调控基因表达，在细胞分化、增殖及凋亡的调节中发挥重要作用[3-4]。miR-141可抑制脑胶质瘤细胞生长并诱导其凋亡，miR-141-3p作为其重要亚型可能也有相似作用[5]；miR-22-3p可通过靶向胶质细胞升高基因-1(AEG-1)抑制非小细胞肺癌细胞的表达[6]，但目前关于上述2种miRNA在胰腺癌中扮演的角色研究极少。本研究检测胰腺癌组织中miR-141-3p、miR-22-3p的表达量，探讨其与疾病特征、预后的内在联系，旨在寻找与胰腺癌发生发展关系密切的分子并为后续靶向治疗提供新思路，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年1月—2017年1月在河北省邯郸市中心医院普外三科进行手术治疗的胰腺癌患者92例作为研究对象，纳入标准：(1)经术中组织病理确诊为原发性胰腺癌；(2)首次确诊疾病并接受手术治疗；(3)符合手术治疗指征且具有完整的临床资料；(4)年龄≤80岁。排除标准：(1)合并其他原发恶性肿瘤性疾病；(2)合并严重营养不良，无法耐受手术创伤；(3)术前接受胰腺癌保守治疗；(4)合并严重出凝血功能异常和/或自身免疫性疾病；(5)合并肺炎等活动性感染。其中男50例，女42例，年龄32～78(57.29±8.11)岁；肿瘤最大直径(3.82±0.86)cm；肿瘤位置，胰头28例，胰体尾64例；TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期27例、Ⅲ～Ⅳ期65例；肿瘤分化程度，低分化40例，中分化39例，高分化13例；淋巴结转移62例，远处转移40例。取患者术中病灶标本及癌旁组织标本各92份进行分析，病灶标本经病理检查确诊为胰腺导管腺癌，癌旁组织标本经病理检查确诊无癌细胞。本研究通过医院伦理委员会审核，患者及家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 实时荧光定量PCR检测miR-141-3p、miR-22-3p在胰腺组织中的表达 取胰腺组织和癌旁组织适量，采用miRNA提取试剂盒(北京天根，CW0627)提取组织中的miRNA，采用miRNA cDNA第一链合成试剂盒(北京天根，SW2142S)将miRNA反转录为cDNA，miR-141-3p引物序列为5’-AGCGATTGAGCTGATGTCG-3’, 3’-TTAGGCTGACCAGTGATGAC-5’，miR-22-3p引物序列为5’-CTTGATGATAAGCTGAAGC-3’, 3’-CCTGAAGATGAGCGTAGGA-5’。采用miRNA实时荧光定量PCR检测试剂盒(北京天根，CW2142S)配置PCR反应体系后按照以下程序进行反应：95℃ 3 min预变性，95℃ 5s、60℃ 15s重复40个循环，根据循环曲线，以U6为内参，计算miR-141-3p、miR-22-3p的表达量。设置癌旁组织中miR-141-3p、miR-22-3p的表达量为标准值100，计算胰腺癌组织中对应miRNA的相对表达量。根据胰腺癌组织中miR-141-3p、miR-22-3p表达量的中位数对胰腺癌患者进行亚分组，具体分为高表达、低表达组各46例。

1.3 预后随访 采用门诊或住院复查、电话回访等方式进行随访，随访截止时间为2019年6月30日，生存时间为确诊日期至死亡日期或截止日期的时间。

1.4 统计学方法 使用软件SPSS 19.0对数据进行统计处理。计量资料符合正态分布，以均数±标准差表示，2组间比较采用独立样本t检验；计数资料以频数或率(%)表示，2组间比较采用χ2检验；绘制Kaplan-Meier生存曲线，用Log-rank检验对2组生存时间的差异进行分析；采用COX多因素风险回归模型分析预后的危险因素。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR-141-3p、miR-22-3p在胰腺组织中的表达比较 胰腺癌组织中miR-141-3p、miR-22-3p的表达量分别为75.39±9.12、64.22±8.07，均低于癌旁组织的100.00，差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1 miR-141-3p、miR-22-3p在胰腺组织中的表达比较

2.2 miR-141-3p、miR-22-3p表达与胰腺癌临床病理特征的关系 不同miR-141-3p表达的胰腺癌患者中，TNM分期、肿瘤分化程度、远处转移的分布差异有统计学意义(P<0.05)，性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤最大直径、淋巴结转移的分布差异无统计学意义(P>0.05)。不同miR-22-3p表达的胰腺癌患者中，远处转移的分布差异有统计学意义(P<0.05)，性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤最大直径、TNM分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移的分布差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.3 miR-141-3p、miR-22-3p表达与预后的关系 患者随访2～38个月，随访中位时间为16个月。miR-141-3p、miR-22-3p高表达组患者的中位生存时间分别为21.2个月、20.8个月，明显高于miR-141-3p、miR-22-3p低表达组患者的8.8个月、9.0个月，miR-141-3p、miR-22-3p高表达组患者生存率高于低表达组，经Log-rank检验，差异有统计学意义(Log-rank χ2/P=6.873/0.009，5.999/0.014)，见图1。

2.4 胰腺癌患者预后的影响因素分析 建立COX比例回归模型，因变量为胰腺癌患者预后状况(存活=0，死亡=1)，根据表2选择P<0.05的TNM分期、肿瘤分化程度、远处转移、miR-141-3p、miR-22-3p为自变量。回归过程采用逐步后退法，共有TNM分期、肿瘤分化程度、远处转移、miR-141-3p、miR-22-3p纳入回归方程，提示TNM分期较高、肿瘤分化程度较低、远处转移、miR-141-3p低表达、miR-22-3p低表达均是导致胰腺癌患者预后不良的危险因素(P<0.05)，见表3。

3 讨 论

胰腺癌预后极差，绝大多数患者在确诊后短期内死亡[7]。手术切除肿瘤是改善胰腺癌患者预后的最主要方式，但很大一部分患者仍出现术后短期内复发或者全身扩散，寻找在胰腺癌发生发展过程中具有重要作用的分子并进行靶向干预可能是未来该病治疗的新手段之一。基于目前miRNA在恶性肿瘤组织中的异常表达及在病情演进过程中发挥的重要作用，推测其在胰腺癌发生发展中也可能发挥一定作用。miR-141-3p、miR-22-3p均是重要的miRNA，国外研究报道，miR-141-3p在多种恶性肿瘤组织中表达不一，如可抑制肾癌细胞生长但对直肠癌细胞具有促生长作用，上调其表达可抑制结直肠癌细胞的生长转移[8-10]；国内研究指出[11]，miR-141-3p异常表达可影响卵巢癌细胞的恶性生物学行为。miR-22-3p由miR-22前体3’端臂剪切而来，其在多种恶性肿瘤组织中呈异常低表达，可抑制乳头状甲状腺癌进展，可能与其靶向抑制ATP环化酶的作用相关[12-14]；抑制miR-22-3p表达可促进肺腺癌进展，上调miR-22-3p表达可抑制肝癌细胞增殖[15-16]。目前国内关于miR-141-3p、miR-22-3p对胰腺癌发生发展的影响研究极少，本研究检测胰腺癌组织、癌旁组织中上述miRNA的表达量发现，胰腺癌组织中miR-141-3p、miR-22-3p的表达量较癌旁组织明显降低，推测异常低表达的miR-141-3p、miR-22-3p参与胰腺癌的发生发展。这与上述2种miRNA对肿瘤的抑制作用吻合，可能与Yoon等[17]的研究中所述靶向STAT4的作用相关，但具体机制未明，有待后续基础研究深入明确。

表2 miR-141-3p、miR-22-3p表达与胰腺癌临床病理特征的关系 [例(%)]

表3 胰腺癌患者预后的影响因素分析

低miR-141-3p、miR-22-3p表达的胰腺癌患者TNM分期较高、肿瘤分化程度较低、远处转移发生率较高，而其在性别、年龄、肿瘤最大直径、淋巴结转移方面的差异则不明显。TNM分期较高、肿瘤分化程度较低、远处转移均与癌症恶性程度关系最为密切，以上结果从临床病理特征方面说明，miR-141-3p、miR-22-3p异常低表达可加剧胰腺癌恶性程度。miR-141-3p低表达促进胰腺癌恶性分化及远处转移的机制不明，国外研究认为，可能与其影响PI3K/Akt信号通路活性、调节trim13相关凋亡通路功能等相关[18-19]。在miR-22-3p影响癌细胞恶性进展的机制方面，有研究认为可能与其调控eIF4EBP3、sirt1等基因表达的作用相关[20-21]，但目前尚无结论。关于miR-141-3p、miR-22-3p对胰腺癌细胞生物学行为影响的直接机制研究目前极少，有待后续研究进一步明确。

经COX回归分析发现，TNM分期较高、分化程度较低、合并远处转移是导致胰腺癌患者生存时间缩短的危险因素，与此同时miR-141-3p、miR-22-3p低表达也是胰腺癌患者预后不佳的直接影响因素，这与上述miR-141-3p、miR-22-3p低表达者的病理特点结果一致，说明miR-141-3p、miR-22-3p低表达可促进胰腺癌病情进展。最后绘制生存曲线发现，miR-141-3p、miR-22-3p低表达的胰腺癌患者生存时间较短，进一步佐证了miR-141-3p、miR-22-3p表达变化对患者预后的影响。

综上所述，胰腺癌组织中存在miR-141-3p、miR-22-3p异常低表达现象，与TNM分期、肿瘤分化程度、远处转移共同成为胰腺癌预后不良的独立危险因素。靶向上调miR-141-3p、miR-22-3p表达量可能成为日后胰腺癌治疗的新思路。本次研究也存在以下局限性，如纳入病例数较少、未涉及miRNA表达影响胰腺癌病情的分子机制，有待后续大样本临床研究、基础研究进一步探讨。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

秦瑞峰：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；薛佳栋：提出研究思路，分析试验数据，论文审核;霍浩然、张佳：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改；袁增江：进行统计学分析