正交实验优化紫背天葵多酚提取工艺

张文展 刘定荣 甘志凯 张淑蕊 邱小林

(南昌理工学院，江西 南昌 330044)

紫背天葵(Gynura bicolor D.C)别名紫背菜、两色三七草、红背菜、观音菜、红军菜等，原产于中国温暖湿润的南方地区，是秋海棠科的多年生无茎草本植物[1-2]。在江西、广东、海南、福建、四川和一些东南亚地区等地均有分布，其中生长在井冈山地区的紫背天葵被当地人称为红军菜。红军菜是井冈山地区著名的野生蔬菜，具有很好的食用价值和药用价值，同时对儿童、妇女和老人还具有较好的保健功能[3-4]。在我国南方一些地区更是把紫背天葵作为一种补血的良药，是产后妇女食用的主要蔬菜之一。相关的药学实验表明[5]，紫背天葵性味甘、凉，具有清热解毒、活血止血、降血压、消肿、抗病毒等功效。据初步研究，紫背天葵中含有丰富营养素和生物活性物质。目前，国内对紫背天葵功效成分提取的研究主要在多糖[6-7]、黄酮类物质[8-10]、紫色素[11]、红色素[1]、及挥发油成分[12]等方面，而对紫背天葵中多酚类物质的提取却鲜有报道。

多酚类物质是植物重要的次生代谢产物，是大多数中药、水果、蔬菜中的功能性成分，包括酚酸、类黄酮、异黄酮、花青素、单宁、儿茶素、花色甙等[13-14]。多酚具有多种显著的生物活性，包括抗氧化，降血糖、降血脂、防止动脉粥样硬化等功效[15]。现代研究表明，水果和蔬菜的摄入量与患心血管疾病、关节炎、慢性炎症、癌症等慢性疾病的风险呈负相关，其主要原因在于水果和蔬菜中含有丰富的多酚类物质。本研究以紫背天葵为主要原料，以乙醇为溶剂提取紫背天葵中多酚，并对相应提取工艺进行优化以精确测定多酚含量，为更好的利用和开发江西井冈山地区的紫背天葵药用植物资源提供科学依据。

1 材料及方法

1.1 材料及试剂

紫背天葵鲜叶，由南昌理工学院井冈山红军菜种植基地提供，60℃烘箱干燥后备用；福林酚试剂，北京宗盛瑞泰科技有限公司；没食子酸标准品，天津欧博凯化有限公司；碳酸钠，天津市永大化学试剂有限公司；乙醇，国药集团化学试剂有限公司。其他所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DHG-9246A电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；FW177中草药粉碎机，天津市泰斯特仪器公司；723可见分光光度计，尤尼柯仪器有限公司；BS224S电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；TGL-16G台式离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 多酚的提取

紫背天葵 60℃烘干5h至恒重，中草药粉碎机打碎，过60目筛精确称量后加入一定浓度乙醇溶液，并选择一定温度置于恒温水浴锅中超声浸提一定时间，最后经过离心、过滤、取上清液等步骤来收集紫背天葵多酚醇提液。

1.3.2 标准曲线的制作

精确称取8mg没食子酸，用蒸馏水定容50mL，得到没食子酸标准溶液。分别取没食子酸标准溶液 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于10mL容量瓶中，加入福林酚试剂0.5mL及1mL 15%的Na2CO3溶液，充分混合后定容到10mL，30℃避光放置1h，以蒸馏水为空白对照，在760nm波长下测定吸光度值，每个样品平行测定3次。以没食子酸标准溶液的浓度(mg/mL)为横坐标，以吸光度值作为纵坐标，绘制相应的标准曲线。

1.3.3 紫背天葵中多酚的提取及含量测定

精密称取0.5g紫背天葵粉至50mL离心管中，加入25mL 60% 乙醇，置于超声提取器中提取30min，然后以4000r/min的速度离心5min。取上清液0.5mL，加入0.5mL福林酚试剂及1mL 15%的Na2CO3溶液，最后用蒸馏水定容至10mL容量瓶，避光1h后测定760nm波长下吸光度值，根据1.3.2标准曲线计算多酚含量。紫背天葵多酚含量以每克样品所含相当于没食子酸的量来表达。多酚的提取率公式如下：

(1)

式(1)中，C为提取液中多酚的浓度(mg/mL)；V为提取液体积(mL)；n为稀释倍数，m为紫背天葵粉的质量(g)。

1.3.4 紫背天葵多酚提取的单因素实验

1.3.4.1 乙醇体积分数对紫背天葵多酚提取率的影响

准确称取干燥的紫背天葵粉末0.5g，按1：50(g/mL)料液比、提取温度40℃、提取时间60min，分别加入体积分数为 0%、20%、40%、60%、80%、95%的乙醇溶液。分析不同乙醇体积分数对多酚提取率的影响。

1.3.4.2 提取温度对紫背天葵多酚提取率的影响

准确称取干燥的紫背天葵粉末0.5g，在乙醇体积分数为60%、料液比为1：50(g/mL)、提取时间60min条件下，分别选择提取温度为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，以分析不同提取温度对紫背天葵多酚提取的影响。

1.3.4.3 料液比对紫背天葵多酚提取率的影响

准确称取干燥的紫背天葵粉末0.5g，在乙醇体积分数为60%、提取温度为40℃、提取时间60min条件下，分别按照料液比为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70(g/mL)进行提取，以分析不同料液比对紫背天葵多酚提取的影响。

1.3.4.4 提取时间对紫背天葵多酚提取率的影响

准确称取干燥的紫背天葵粉末0.5g，在乙醇体积分数为60%、料液比为1：50(g/mL)、提取温度为40℃条件下，分别测定超声提取时间为10min、20min、30min、40min、50min、60min时紫背天葵多酚的提取率，以分析提取时间对紫背天葵多酚提取的影响。

1.3.5 正交试验设计优化提取条件

根据上述的单因素实验，选择乙醇浓度、提取温度、料液比和提取时间四因素的最好水平，设计正交试验。因素水平设计表如表1所示。

表1 正交试验因素水平表

2 结果与讨论

2.1 没食子酸标准曲线

根据没食子酸的浓度与吸光度，得到没食子酸标准曲线如图1所示，标准曲线的回归方程为Y=94.52X+0.038，式中Y为吸光度，X为没食子酸的浓度(mg/mL)，方程线性回归系数R2=0.995。

图1 没食子酸标准曲线

2.2 单因素实验

2.2.1 乙醇体积分数对紫背天葵多酚提取率的影响

乙醇体积分数对紫背天葵多酚提取率的影响，见图2。

图2 乙醇体积分数对紫背天葵多酚提取率的影响

由图2可知，当乙醇体积分数在20% ～ 40%之间时，随着乙醇体积分数的增加，紫背天葵多酚的提取率呈上升趋势，且在乙醇浓度达到40%时紫背天葵多酚提取得率达到最大值7.08mg/g，之后随着乙醇浓度的继续增加，紫背天葵多酚的提取率反而开始下降。这可能是由于乙醇体积分数过低时，糖类等水溶性物质大量溶出，不利于有效成分的溶解和吸收[16]；而乙醇体积分数过高时，脂溶性物质大量溶出，影响紫背天葵多酚的溶出，从而影响紫背天葵多酚的含量。综合以上结果，乙醇的最适体积分数为40%。

2.2.2 提取温度对紫背天葵多酚提取率的影响

提取温度对紫背天葵多酚提取率的影响，见图3。

图3 温度对紫背天葵多酚提取率的影响

如图3所示，随着提取温度的升高，紫背天葵多酚提取率先上升后缓慢下降，在50℃时达到最大值。这是由于多酚物质在10℃～50℃的低温区间时一般性质较稳定，且随着温度的升高其在乙醇水溶液中的溶解度增大，黏度减少，扩散系数增加，浸提速度加快，浸提量增加，因此浸提液中多酚含量也会随之增高。而当温度超过50℃之后，紫背天葵多酚提取率开始下降，这是由于多酚的热稳定性较差，长时间受热时会发生氧化水解反应[17]。因此50 °C为适宜的提取温度。

2.2.3 料液比对紫背天葵多酚提取率的影响

料液比对紫背天葵多酚提取率的影响，见图4。

图4 料液比对紫背天葵多酚提取率的影响

多酚与溶剂间的浓度差是多酚提取的推动力，选择合适的料液比不仅可以提高多酚的提取速率，还能降低溶剂消耗和生产成本[18]。由图4可知，随着料液比的增加，紫背天葵多酚的提取得率随之增加。当料液比达到1∶50(g/mL)后，多酚物质含量增加的不明显。这是由于多酚物质已基本全部溶出，再增加溶剂含量效果也不会显著。因此，为提高效率降低成本，选择料液比为1∶50(g/mL)较为合适。

2.2.4 提取时间对紫背天葵多酚提取率的影响

提取时间对紫背天葵多酚提取率的影响，见图5。

图5 提取时间对紫背天葵多酚提取率的影响

由图5可知：提取时间在10min至30min时，随着超声提取时间的延长，紫背天葵多酚的提取率明显增加；超过30min后增加较缓慢，在50min时提取率达到最高值；提取时间大于50min后，紫背天葵多酚的提取率反而下降。这可能是由于紫背天葵中的多酚物质在最初的30min内已基本提取完成，随着提取时间的延长，可溶出的多酚物质越来越少。如果提取时间过长，部分多酚物质还会被氧化，导致多酚含量下降[19]。因此，30 min为适宜的提取时间。

2.3 正交试验结果分析

由表2可知，四种因素对多酚提取效果的影响顺序依次为：A(乙醇浓度)>C(料液比)> B(提取温度)> D(提取时间)；正交实验得到的最佳工艺组合为A1B2C3D1，即乙醇体积分数40%，提取温度50℃，料液比为1∶60，提取时间30min。但通过单因素实验可知，料液比为1∶50和1∶60时紫背天葵多酚提取量基本相同，为节省成本料液比选取1∶50。因此可取最佳工艺组合为乙醇体积分数40%，提取温度50℃，料液比为1∶50，提取时间30min。

表2 正交试验结果表

2.4 紫背天葵中多酚含量

在最佳提取条件下，对紫背天葵中多酚重复提取三次，并进行含量测定。表3结果表明紫背天葵中多酚含量为10.88 mg/g，前两次提取率占到三次提取总量的88.5 %。

表3 紫背天葵中多酚含量提取结果

3 结论

通过单因素试验和正交试验，确定了利用超声波辅助提取紫背天葵中多酚的最佳工艺参数为：乙醇体积分数40%，料液比 1∶50(g/mL)，提取温度50℃，提取时间50min，在此最优条件下，多酚提取量为 10.88mg/g。本实验为紫背天葵的进一步纯化和活性研究奠定了基础，也为更好的综合利用和开发江西井冈山地区紫背天葵药用资源提供技术参考依据。

*基金项目：江西省教育厅科学技术青年基金项目(GJJ171052)；江西省南昌市2017年度“洪城特聘专家”项目；江西省教育厅科学技术重点项目(GJJ161153)。