腺苷脱氨酶在儿童EB病毒相关噬血细胞综合征中的意义

高 慧 张俊峰 刘娟娟 沈红强

噬血细胞综合征又称噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(hemophagocyticlymphohistiocytosis，HLH)，是免疫系统过度活化的炎性反应综合征，是儿科危重难治性疾病，临床上以持续高热和巨噬细胞活化产生噬血现象为主要特征[1]。HLH分为原发性和继发性两种类型，原发性HLH由遗传性免疫缺陷导致，而继发性HLH常由感染、肿瘤、自身免疫性疾病诱发。无论原发性还是继发性，感染都是最常见的触发因素，而EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)感染最多见。EBV相关噬血细胞综合征可在慢性活动性EB病毒感染基础上发生HLH，因此寻找对EBV-HLH早期诊断与鉴别诊断及预后评估有价值的临床指标具有重要意义。

腺苷脱氨酶(ADA)是一种与机体细胞免疫活性有重要相关性的核酸代谢酶，ADA在淋巴细胞尤其是T淋巴细胞分化成熟中具有重要作用[2]。大量研究表明，血清或体液ADA水平在结核性脑膜炎、系统性红斑狼疮患者及2型糖尿病等的鉴别诊断和免疫功能研究中具有重要的临床意义[3～5]。

本研究通过检测EBV-HLH患儿血清ADA水平，分析其在鉴别诊断EBV-HLH与慢性活动性EBV感染、评估临床疗效和预后判断中的价值。

对象与方法

1.研究对象：选取2015年1月～2017年12月在浙江大学医学院附属儿童医院初次入院确诊为EBV-HLH的72例患儿为研究对象，同期80例慢性活动性EBV感染患儿为对照组，健康体检儿童为健康对照组，年龄1～18岁。EBV-HLH诊断标准[6]：有明确EBV感染证据并符合HLH-2004指南的诊断标准。定义外周血浆中EBV-DNA拷贝数>500拷贝数/毫升即诊断为EBV感染; HLH的诊断参照国际组织细胞学会制定的HLH-2004方案，满足符合以下8项中的5项：①发热；②脾肿大；③外周血两系或三系减少血红蛋白<90g/L、 血小板计数<100×109/L、中性粒细胞绝对值<1.0×109/L；④高甘油三酯血症或低纤维蛋白原血症(甘油三酯≥3.0mmol/L, 纤维蛋白原<1.5g/L)；⑤血清铁蛋白升高(≥500μg/L);⑥可溶性CD25升高(≥2400U/ml)；⑦NK细胞活性减低或缺失；⑧骨髓、脾脏、脑脊液或淋巴结活检发现组织细胞增生并伴噬血细胞现象, 且无恶性疾病证据。CAEBV感染诊断参照2005年Okano 等[7]修订的诊断标准。

2.研究方法：所有研究对象为当日空腹静脉血3ml，3000r/min，离心10min，取血清后于当天检测。贝克曼AU5800全自动生化分析仪及配套试剂，采用酶法测定ADA、ALT及AST。检测前当日室内质量控制均在控。根据ALT、AST水平将EBV-HLH患者分为肝功能正常组和肝功能异常者，比较两组间ADA水平。并比较分析肝功能正常的EBV-HLH患者和健康对照组ADA水平差异。根据患者临床治疗转归，将72例EBV-HLH患者分为生存组与死亡组，对比分析两组间实验室特征。采用荧光定量PCR分析仪检测血浆EBV DNA拷贝数，并对ADA水平与EBV DNA拷贝数进行相关性分析。

结 果

1.临床资料：EBV-HLH组和CAEBV组患儿一般临床资料详见表1。72例EBV-HLH患儿年龄为1岁1个月～14岁3个月，中位年龄为2.8岁，其中男性38例，女性34例; CAEBV组患儿80例，其中男性38例，女性42例,患儿年龄6个月～12岁7个月，中位年龄2.7岁。同期健康体检者为对照组50例，其中，男性26例，女性24例，中位年龄3.2岁。

表1 EBV-HLH组和CAEBV组患儿一般情况和临床实验室指标分析

2.EBV-HLH组、CAEBV组及健康对照组患儿ADA水平比较: EBV-HLH组ADA水平为102.4±64.9U/L, CAEBV组ADA水平为42.8±22.1U/L，而健康对照组的 ADA 水平为13.3±3.2U/L，通过非参数检验得出3组间比较差异有统计学意义(P=0.000), EBV-HLH组ADA水平明显高于CAEBV组(Z=4.709，P=0.000)，CAEBV组显著高于健康对照组，差异有统计学意义(Z=5.008，P=0.000),详见图1。

图1 EBV-HLH组、CAEBV组和健康对照组ADA水平比较

3.ROC分析: 根据EBV-HLH组及CAEBV组血清ADA水平绘制ROC曲线，以CAEBV组为对照，分析得出ADA诊断EBV-HLH的ROC曲线下面积为0.801，95%CI:0.827～0.940，取其阈值为57.5U/L时，敏感度为74.7%，特异性为89.1%，详见图2。

4.肝脏功能对ADA水平的影响: 根据ALT、AST水平(表2)，将EBV-HLH组分为肝功能正常组和肝功能异常组，前者24例，后者48例。肝功能正常的EBV-HLH患儿ADA水平为63.57±39.95U/L，肝功能异常的EBV-HLH患儿中ADA 水平为120.65±66.64U/L，其中肝功能正常的EBV-HLH患者 ADA 水平与健康对照组比较，差异有统计学意义(Z=6.121，P=0.000)。并且肝功能正常的EBV-HLH患者 ADA 水平与肝功能异常的患者比较，差异有统计学意义(Z=-3.583，P=0.000)。

图2 EBV-HLH患者ADA分布的ROC曲线

表2 EBV-HLH患者肝功能状况分析

5.EB病毒DNA拷贝数与ADA的相关性分析: 72例EBV-HLH患儿EB病毒拷贝数为4.39±1.18logU/ml,Pearson相关分析得出，EBV拷贝数与ADA相关系数r=0.608，呈正相关，差异有统计学意义(P=0.000)，详见图3。

6.生存组和死亡组实验室特征比较：死亡组血清ADA水平显著高于存活组(P=0.002)，血小板计数水平明显降低(P=0.048)，详见表3。

图3 ADA水平与EBV-DNA载量的相关性

表3 生存组和死亡组EBV-HLH患儿实验室特征比较

讨 论

ADA是机体细胞免疫系统中一种重要核酸代谢酶,主要存在于粒细胞、红细胞和淋巴细胞中。随着淋巴细胞分化程度的增高,其酶活力逐渐降低。近年来血清及体液中ADA活性测定已在多种疾病的诊断、鉴别诊断以及免疫障碍机制研究中越来越受到重视[8]。ADA在T淋巴细胞中的活性要高于B淋巴细胞，且可作为非特异性分子，在T淋巴细胞增殖、分化和成熟过程中发挥重要作用[9]。

EBV相关噬血细胞综合征可在慢性活动性EB病毒感染基础上发生暴发性HLH，也可在传染性单核细胞增多症过程中反复发作导致患者死亡。因此寻找对EBV-HLH早期诊断与鉴别诊断及预后评估有价值的临床指标具有重要的意义。本研究旨在探讨血清ADA水平在EBV相关噬血细胞综合征中的意义。本研究结果显示，EBV-HLH患者ADA水平明显高于EBV感染组，EBV感染组患儿显著高于健康体检者。Chen等[10]研究发现血清ADA水平在淋巴瘤相关噬血细胞综合征中显著升高。以上结果提示，ADA 的检测可为临床鉴别诊断EBV-HLH提供有效的参考。本研究进一步分析ADA水平与EB病毒拷贝数的相关性，得出相关系数为0.608，呈正相关。研究表明，血浆EB病毒拷贝数可以作为生物学标志物评价EBV感染相关性疾病的严重程度和预后[11]。进一步比较EBV-HLH患者生存组与死亡组实验室特征，死亡组ADA水平显著高于生存组，同时结果表明，血清ADA活性有助于判断EBV-HLH患者预后情况。

根据EBV-HLH患者和EBV感染患者血清ADA水平绘制ROC曲线。结果显示 ADA的曲线下面积为0.893，95%CI:0.827～0.940。当阈值为57.5U/L时，敏感度为74.7%，特异性为89.1%。说明诊断准确性较高，具有较高的诊断价值。文献证实，ROC曲线下面积>0.9表明筛查价值很高,>0.7表明筛查价值中等[12]。结果提示，血清ADA水平在诊断EBV-HLH特别是预警CAEBV进展为 HLH 时，具有重要参考价值。

研究证实，无论何种原因造成肝细胞受损、坏死或膜通透性增加，均能导致血清ADA活性增高[13]。在本研究中，肝功能异常的EBV-HLH患者ADA水平高于肝功能异常的患者，且肝功能正常的EBV-HLH患者与健康体检者血清ADA水平比较，差异有统计学意义。说明在噬血细胞综合征中，ADA的分泌增加不仅来源于肝细胞的破坏，而且来源于淋巴细胞的释放增加。可能的机制是在EBV-HLH中， EB病毒主要感染CD8+T细胞亚群，而在慢性活动性EBV感染中，EB病毒主要侵犯CD4+T细胞亚群或NK细胞[14]。EBV作用于不同的宿主细胞，可能是两种EBV相关性疾病发病机制和临床特征不同的重要基础。Moreno等[15]研究发现，在T细胞和巨噬细胞活化过程中，ADA结合CD26分子产生共刺激信号，使Th1细胞显著增加，释放大量的促炎因子IFN-γ、TNF-α及IL-6。同时ADA受IL-2、IL-12的正向调控。本研究发现，EBV-HLH患儿ADA水平显著升高，提示T淋巴细胞免疫在EBV-HLH的发病机制中发挥着重要作用，为噬血细胞综合征中细胞因子风暴及Th1过度激活提供更有力的理论依据[16]。

综上所述，本研究肯定ADA 在EBV-HLH患者辅助诊断中的价值，且在鉴别CAEBV是否进展为 EBV-HLH时，具有重要意义。ADA活性有助于判断EBV-HLH患者预后情况。因而，ADA 检测可以成为EBV-HLH患者的一项常规辅助检查，可以更好地诊断疾病并反映患者病情的发展。本研究仍然存在很多不足，如病例数偏小，为单中心观察性临床研究，且ADA对EBV-HLH的诊断价值未与其他指标如铁蛋白、sCD25等做对比性研究，期待今后开展多中心、大样本的研究来进一步证实。