1,6-二磷酸果糖三钠盐的毒理学研究
2020-03-31郭婉王颖艳张彪
郭婉,王颖艳,张彪
(张家港市华天药业有限公司,江苏 张家港)
0 引言
1,6-二磷酸果糖三钠盐(Fructose 1,6-diphosphate trisodium salt),简称FDP,是糖酵解过程中一种重要的代谢产物,具有调节糖酵解中限速酶磷酸果糖激酶及丙酮酸酶活性的功效,可以从分子水平恢复、改善细胞代谢[1-2]。其口服制剂和注射液临床上多用于治疗心绞痛、心肌缺血、心肌梗死、休克或大面积烧伤等[3-4]。除了临床应用外,FDP还具有抗疲劳、耐缺氧的保健功能。关于FDP的安全性,已经有注射毒性研究的报道[5-6]。本文针对1,6-二磷酸果糖三钠盐(FDP)的口服应用,进行了急性毒性试验和遗传毒性试验,为口服用药和保健食品的开发提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1,6-二磷酸果糖三钠盐,白色结晶粉末,纯度≥96%,由国内某企业提供。
1.2 试验动物
由山东大学实验动物中心提供的健康SPF级昆明种小鼠。实验环境温度20℃~24℃,相对湿度40%~60%。
1.3 试验方法
1.3.1 小鼠急性毒性试验(最大耐受量MTD试验)
健康昆明种小鼠20只,雌雄各占一半,体重为18~22g。取样品10g,用蒸馏水溶解并定容至25mL,小鼠空腹16h后,每次间隔4h,以0.25mL/10g.bw容量灌胃2次,总剂量为20.0g/kg.bw,连续观察14天并记录小鼠中毒表现及死亡情况。
1.3.2 遗传毒性试验
1.3.2.1 Ames试验
采用鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102四株试验菌进行试验,多氯联苯(PCB)诱导的大鼠肝匀浆为体外代谢活化系统。试验组设 8、40、200、1000、5000μg/皿 5 个剂量,每个剂量做3个平行。称取1.25g样品,用蒸馏水溶解并定容至25mL,混匀,灭菌,4℃存放备用。临用前将上述溶液依次用灭菌蒸馏水稀释成:50000μg/mL(原液)、10000μg/mL、2000μg/mL、400μg/mL、80μg/mL。在顶层琼脂中加入0.1mL试验菌液、0.1mL受试样品溶液(溶剂对照组加0.1mL灭菌蒸馏水)和0.5mL S-9混合液(需要代谢活化时),混匀后倒入底层培养基平板。设自发回变和阳性对照。37℃培养48h并计数每皿回变菌落数。受试物的回变菌落数达到自发回变菌落数的2倍以上,并具有剂量-效应关系则为阳性。试验在相同条件下重复操作两次。
1.3.2.2 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验
筛选50只体重25g~30g小鼠,随机分5组,每组10只,雌雄各半。受试物设2.50、5.00、10.00g/kg.bw三个剂量。以环磷酰胺(剂量为40mg/kg.bw)为阳性对照,蒸馏水为阴性对照。分别称量受试物 2.50、5.00、10.00g,用蒸馏水溶解,定容至25mL,灌胃量为0.25mL/10g.bw。间隔24h,共灌胃2次,末次灌胃后6h,处死小鼠,取胸骨骨髓涂片并固定染色,在光学显微镜下,观察200个嗜多染红细胞PCE并计数正染红细胞NCE,计算PCE/NCE比值,每只小鼠计数1000个嗜多染红细胞,对微核率(以含微核的嗜多染红细胞千分率计)进行统计学处理。
1.3.2.3 小鼠精子畸形试验
筛选25只体重30g-35g的性成熟雄性小鼠,随机分5组,每组5只,受试物剂量分别为2.50、5.00、10.00g/kg.bw。以环磷酰胺(40mg/kg.bw)为阳性对照,蒸馏水为阴性对照。分别称取受试物 2.50、5.00、10.00g,用蒸馏水溶解,定容至 25mL,灌胃量为0.25mL/10g.bw。每天灌胃,连续5天,末次灌胃后30天处死小鼠,取附睾制片,染色,每组统计5只动物,每只动物计数1000个精子,要求结构完整,计算精子畸形率(以百分率计)并进行统计学处理。
2 结果与分析
2.1 急性毒性试验
由表1可见,将1,6-二磷酸果糖三钠盐以20.0g/kg.bw的剂量给小鼠灌胃后,部分小鼠出现步态不稳,易跌倒,约45min后症状消失,继续观察14天,无明显的中毒症状,也无死亡。将小鼠处死后进行解剖检查,心脏、肺、肝脏、脾脏、肾脏、胃、肠等主要器官,均未见明显异常改变。受试样品对雌雄小鼠的MTD均大于20.0g/kg.bw。
2.2 遗传毒性试验
2.2.1 Ames 试验
由表2、表3可见,1,6-二磷酸果糖三钠盐各剂量组回变菌落数均不超过自发回变菌落数的2倍,且无剂量-效应关系,对鼠伤寒沙门氏菌四株菌株,在加与不加S-9混合液时,均未呈现遗传毒性。
2.2.2 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验
由表4可见,1,6-二磷酸果糖三钠盐各剂量组与阴性对照组相比微核率无统计学差异(P>0.05);环磷酰胺组与阴性对照相比有显著性差异(P<0.01)。1,6-二磷酸果糖三钠盐对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率无影响。各组未见明显细胞毒性。
表2 1,6-二磷酸果糖三钠盐-Ames试验结果1
表3 1,6-二磷酸果糖三钠盐-Ames试验结果2
表5 1,6-二磷酸果糖三钠盐对小鼠精子畸形率的影响
2.2.3 小鼠精子畸形试验
受试物各剂量组小鼠精子畸形率分别为1.84%、1.76%、1.90%,与阴性对照组1.82%相比差异不显著性(P>0.05),而环磷酰胺组精子畸形率5.18%与阴性对照组相比有显著差异(P<0.01)。1,6-二磷酸果糖三钠盐对小鼠精子畸形率无影响。
3 结论
表4 1,6-二磷酸果糖三钠盐对小鼠骨髓微核率的影响
经口给予小鼠1,6-二磷酸果糖三钠盐进行急性毒性试验,两种性别动物的MTD均大于20.0g/kg.bw。按照《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)[7]中的急性毒性分级标准,1,6-二磷酸果糖三钠盐属于无毒级。遗传毒性试验中,1,6-二磷酸果糖三钠盐Ames试验结果为阴性,对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率和小鼠精子畸形率均无影响,无遗传毒性。
4 讨论
1,6-二磷酸果糖三钠盐是以葡萄糖为原料,经酿酒酵母发酵制成的。据报道,口服1,6-二磷酸果糖三钠盐具有抗酒精中毒、抗疲劳、耐缺氧的功效[8-11],作为保健食品原料有很好的应用前景。冯美云等研究了1,6-二磷酸果糖营养液对人体抗疲劳能力的影响,试验组服用1.8g/d,可加快运动后心率的恢复,增加血乳酸的消除速率,提高无氧代谢的输出功率和总功[12]。Chen Hongnian等人研究了1,6-二磷酸果糖钠盐抗疲劳作用的药效学,实验组运动员服用1,6-二磷酸果糖钠盐可加快消除血乳酸、降低训练后肌酸激酶水平,恢复磷酸果糖激酶活性,在厌氧训练后抗疲劳作用明显[13]。上述文献[8-13]中试验动物和运动员均未出现不良反应的报道。
本实验对1,6-二磷酸果糖三钠盐的安全性进行了初步评价,小鼠的最大耐受量大于20.0g/kg.bw,属于无毒级且无遗传毒性,为进一步的安全论证和产品的开发提供了理论依据。