玉米秸秆半同步糖化共发酵产乙醇的研究

朱圆圆,卢仟旭,朱均均,徐 勇,余世袁

(1.江苏科技大学 粮食学院, 镇江 212004) (2.南京林业大学 化学工程学院, 南京 210037)

利用木质纤维原料生物炼制产乙醇的过程主要包括:原料预处理、纤维素酶制备[1]、原料的酶水解和乙醇发酵等[2]．其中得到可发酵性糖继而进行后续乙醇发酵是整个生物炼制过程的关键步骤之一[3]．现有的糖化发酵工艺主要有:同步糖化发酵(SSF)工艺[4]、分步糖化发酵(SHF)工艺[5]和同步糖化共发酵(SSCF)工艺[6]．预酶解在本质上是将同步糖化发酵工艺与分步糖化发酵工艺相结合的一项工艺,由于温度对酶解的影响十分显著,预酶解的过程能先将一部分底物在酶解的最适宜条件下降解为可发酵性糖,然后降至发酵温度进行同步糖化共发酵[7]．同时,碱法预处理是一种有效的预处理方法[8]．通过两步碱预处理可以去除大部分乙酰基,继而能提高后续的乙醇得率[9-10]．但碱预处理后的物料碱度较高,虽然大量水洗可有效脱除已溶解的半纤维素及抑制物,提高水洗后物料的酶解纤维素转化率且有利于后续的发酵过程,但存在水资源浪费及废水污染等问题,不适合工业化生产．

文中分别以水洗和未水洗两步碱法(氢氧化钠-氢氧化钙)为原料,在传统同步糖化共发酵工艺的基础上,发酵之前先预酶解一段时间，然后进行己糖戊糖共发酵,即半同步糖化共发酵(semi-SSCF)．由于半同步糖化共发酵过程中酶解和发酵的pH不一致,本实验主要考虑了发酵过程中pH对乙醇得率的影响，以期为木质纤维原料非等温同步糖化共发酵的工业化生产提供理论支持．

1 材料与方法

1.1 玉米秸秆两步碱法预处理

玉米秸秆(黑龙江省肇东市)粉碎至0.2～0.4 mm后，将经过第一步氢氧化钠预处理(氢氧化钠质量浓度5.45 g/L,液固比13 ∶1 g/mL,温度62 ℃,时间45 min)后得到的固体渣，水洗至中性后进行第二步氢氧化钙预处理(氢氧化钙0.100 g/g玉米秸秆、温度90 ℃、时间36 h[11])．预处理结束后,部分物料水洗至中性,将水洗和未水洗的物料分别保存备用．

1.2 酶制剂

纤维素酶(C2730)来自TrichodermareeseiATCC 26921,β-葡萄糖苷酶(C6105)来自Aspergillusniger,均由丹麦诺维信(Novozyme)生产,Sigma公司．

1.3 乙醇发酵

1.3.1 菌种 树干毕赤酵母PichiastipitisNLP 31,保藏于南京林业大学生物化工研究所,保存在4 ℃木糖-蛋白胨-酵母浸膏-琼脂斜面上．

1.3.2 培养基 斜面培养基、活化及增殖培养基,发酵培养基的配制按文献[12]进行．

1.3.3 活化及增殖培养条件 树干毕赤酵母活化及增殖培养条件:温度30 ℃,转速170 r/min．当酵母增殖几轮后,将离心后的酵母转入发酵培养基中进行乙醇发酵．

1.3.4 三角瓶发酵方法 分别称取10 g绝干水洗/未水洗预处理玉米秸秆放于250 mL三角瓶中,每个三角瓶中加入1 mol/L柠檬酸缓冲液5 mL(稀释20倍后pH为4.8)、适量酶液和水,使液体总体积为97 mL．纤维素酶用量为35 FPU/g(以纤维素计,下同),β-葡萄糖苷酶用量为35 IU/g．在50 ℃、150 r/min的摇床中预酶解48 h,然后取出降温至30 ℃左右．分别加入2 mL树干毕赤酵母用营养盐浓液(×50)、1 mL的微量元素浓液(×100),并接入初始OD600=6的树干毕赤酵母,充分混匀后,置于30 ℃、150 r/min的摇床中进行糖化发酵．

1.3.5 发酵罐发酵方法 实验所用3 L发酵罐由New Brunswick Scientific公司生产,装液量为1 L,用10%的硫酸和氢氧化钠调控发酵液pH．使用前要对pH电极和溶氧电极进行校正．对pH电极进行校正时,使用发酵罐系统自带的pH为4.01和7.01的标准缓冲液进行两点法校准．对溶氧电极进行校正时,将饱和亚硫酸钠水溶液中的溶解氧作为零点(0),将尚未接入酵母的、与发酵条件完全相同的培养基中的溶解氧作为饱和点(100%)[13]．

分别称取100 g绝干水洗/未水洗预处理玉米秸秆于3 L发酵罐中,并加入1 mol/L柠檬酸缓冲液50 mL(稀释20倍后pH为4.8)、适量酶液和水,使液体总体积为970 mL．纤维素酶用量为35 FPU/g(以纤维素计,下同),β-葡萄糖苷酶用量为35 IU/g．前48 h发酵罐转速保持在400 r/min,温度控制在50 ℃;48 h之后将转速调为300 r/min,温度控制在30 ℃,分别加入20 mL树干毕赤酵母用营养盐浓液(×50)、10 mL的微量元素浓液(×100),并接入初始OD600=6的树干毕赤酵母．实验中前48 h通风量为0,后48 h通风量控制在0.05 L·L-1·min-1,空气由空气压缩泵输入罐体,并通过气体转子流量计控制流量,再经过0.22 μm的空气过滤膜进入罐体．

1.4 实验方法

1.4.1 原料分析 原料中纤维素、半纤维素和木质素含量的分析按美国可再生能源实验室(NREL)的方法测定[14]．

1.4.2 糖、乙醇、甘油及抑制物定量分析 糖(纤维二糖、葡萄糖和木糖)、乙醇、甘油、抑制物(乙酸、5-羟甲基糠醛和糠醛等)定量分析在美国Agilent 1260型高效液相色谱仪上进行,外标法测定[12]．采用Bio-Rad HPX-87H柱(7.8 mm×300 mm),柱温55 ℃,流动相5 mmol/L的硫酸,流速0.6 mL/min,上样量10 μL,示差折光检测器．计算方法:乙醇产率为生成的乙醇质量与发酵液中纤维素和半纤维素的质量的比值．

1.4.3 酵母浓度的测定 采用比浊法测定[15]酵母浊度(OD)．将发酵液混匀后稀释至一定倍数,测定其在600 nm的吸光度并乘以稀释倍数即为酵母浊度(OD)．

酵母浓度(Y)与酵母浊度(OD)的方程为:

Y=1.669 4X-0.160 9

式中:Y为酵母浓度,g/L;X为酵母浊度(OD)．

2 结果与讨论

2.1 两步碱法预处理玉米秸秆水洗前后成分分析

两步碱法(氢氧化钠-氢氧化钙)预处理玉米秸秆水洗前后的成分分析结果见表1．

表1 两步碱法预处理玉米秸秆成分分析

预处理后的玉米秸秆用大量蒸馏水水洗至中性,其纤维素含量为53.40%、半纤维素含量为24.54%、酸不溶木质素含量为8.46%、酸溶木质素含量为1.25%．未水洗玉米秸秆即预处理后的玉米秸秆不经过水洗而直接用硫酸中和,其纤维素含量为41.84%、半纤维素含量为22.25%、酸不溶木质素含量为10.45%、酸溶木质素含量为2.04%．文献[16]的研究表明，水洗蒸汽爆破甘蔗渣比未水洗纤维素含量提高7%,其原因是水洗使部分半纤维素和木质素溶出导致纤维素含量的相对提高．同时,对水洗后滤液中抑制物含量进行分析可发现,对发酵影响比较大的甲酸和乙酸含量分别为0.39和0.54 g/L．有研究结果表明,当木糖发酵培养基中含有5.00 g/L的乙酸时，树干毕赤酵母完全被抑制[17]．这也从另一方面说明可以将预处理后的物料不经过水洗,加入中和剂后直接进行乙醇发酵．

2.2 未水洗两步碱法处理玉米秸秆半同步糖化共发酵

2.2.1 三角瓶体系

(1) 发酵pH 4.8时对半同步糖化共发酵的影响 未水洗两步碱法预处理玉米秸秆先在pH 4.8、温度50 ℃、转速150 r/min的条件下预酶解48 h,然后取出降温至30℃左右,同时维持pH不变为4.8．接着加入OD600=6的树干毕赤酵母,充分混匀后,置于30 ℃、150 r/min的摇床中进行半同步糖化共发酵,其葡萄糖、木糖和乙醇的浓度(C)随时间的变化如图1．

图1 三角瓶体系中未水洗物料预酶解48 h后维持pH 4.8进行半同步糖化共发酵各参数的变化Fig.1 Changes in the parameters during the semi-SSCFof un-washed materials after pre-enzymatic hydrolysis of48 h and keeping pH at 4.8 in an Erlenmeyer flask system

从图1可以看出,预酶解前48 h随着时间的延长，葡萄糖和木糖浓度不断增加,至48 h时其浓度分别达到34.83和8.25 g/L；至108 h时葡萄糖基本被利用完,132 h时木糖也基本被利用完．随着葡萄糖和木糖不断被利用，乙醇浓度也在不断增加,120 h时达到最高值13.92 g/L,乙醇产率为0.193 g/g．乙醇产率不高是由于未水洗物料中抑制物含量相对较高.文献[17]研究了乙酸对木糖发酵酵母休哈塔假丝酵母Candidashehatae、嗜单宁管囊酵母PachysolentannophilusNRRL Y-2460、树干毕赤酵母PichiastipitisCBS 5773的影响．研究结果表明,当培养基中添加0.5%(V/V)的乙酸(pH 4.1)时就能完全抑制C.shehatae、P.stipitisCBS 5773的生长,只有P.tannophilusNRRL Y-2460表现出较低的增长和乙醇发酵．然而当培养基中添加1%(V/V)的乙酸(pH 3.7)时,3种菌株均完全被抑制．由于预酶解之后pH没有改变还是为4.8,在此pH下抑制物的作用比较明显,所以可以采用预酶解之后将pH调高的方法减弱抑制物对发酵的影响．同时,文献[18]的研究表明，对于碱性过氧化预处理,物料不经过水洗其乙醇得率为76.80%,水洗之后乙醇得率为81.40%,虽然水洗之后的乙醇得率提高了5%左右,但是综合考虑水洗之后的废水处理、水的消耗等问题，可以将预处理完的物料进行直接发酵．

(2) 发酵pH 6.0时对半同步糖化共发酵的影响 未水洗两步碱法预处理玉米秸秆先在pH 4.8、温度50 ℃、转速150 r/min的条件下预酶解48 h,然后取出降温至30 ℃左右,同时将pH调至6.0,接着加入OD600=6的树干毕赤酵母,充分混匀后,置于30 ℃、150 r/min的摇床中进行半同步糖化共发酵,其葡萄糖、木糖和乙醇的浓度随时间的变化如图2．

图2 三角瓶体系中未水洗物料预酶解48 h后调节pH至6.0进行半同步糖化共发酵各参数的变化情况Fig.2 Changes in the parameters during the semi-SSCFof un-washed materials after pre-enzymatic hydrolysis of48 h and adjusting pH to 6.0 in an Erlenmeyer flask system

从图2可以看出,预酶解前48 h随着时间的延长葡萄糖和木糖浓度不断提高,48 h时葡萄糖和木糖浓度分别达到31.27和8.27 g/L；72 h时葡萄糖基本被利用完,84 h时木糖也基本被利用完．随着葡萄糖和木糖不断被利用，乙醇浓度也在不断增加,84 h时乙醇浓度达到最高值17.97 g/L,乙醇产率为0.234 g/g．与未水洗物料预酶解48 h后不改变pH值相比，其乙醇产率得到很大提高,所以在后续发酵罐实验中可采取在pH 4.8下先预酶解48 h然后将pH调至6.0．文献[19]以稻草为原料,经氢氧化钙预处理后不固液分离而用CO2中和至pH 6.0,然后用树干毕赤酵母发酵,其乙醇得率为74%．文中采用经两步碱(氢氧化钠-氢氧化钙)预处理的玉米秸秆为原料，由于第一步氢氧化钠预处理去除了95.19%的乙酸[9],第二步氢氧化钙预处理的浆料不水洗而直接用50%硫酸中和至中性,其发酵抑制物含量较少，更适宜不经过水洗直接进行发酵．

2.2.2 发酵罐体系 为了更好地探寻半同步糖化的发酵规律,在3 L发酵罐中进行放大实验,并通过发酵罐自带的系统调控各发酵参数．由三角瓶系统实验结果可知,当预酶解48 h之后将pH调至6.0时的乙醇产率和乙醇含量相比于预酶解48 h之后不改变pH有很大提高.因此,在发酵罐体系中采用在pH 4.8下先预酶解48 h,然后将pH调至6.0,再接入OD600=6的树干毕赤酵母进行半同步糖化共发酵；48 h之前不通气,48 h之后通气量为0.05 L/min，其葡萄糖、木糖和乙醇浓度随时间的变化如图3．

从图3可以看出,预酶解前48 h随着时间的延长葡萄糖和木糖浓度不断增加,48 h时葡萄糖浓度和木糖浓度分别达到29.66和7.62 g/L．72 h时葡萄糖基本被利用完,78 h时木糖也基本被利用完．随着葡萄糖和木糖不断被利用，乙醇浓度也在不断增加,78 h时乙醇浓度达到最高值14.72 g/L,乙醇产率为0.220 g/g．与摇瓶实验相比，乙醇产率和乙醇浓度略有下降,主要是因为发酵罐的通气量较大且乙醇又易挥发．同时,由于氢氧化钙与稀硫酸中和时生成的CaSO4沉淀吸附于纤维素表面,降低了纤维素的活性位点,妨碍了纤维素酶吸附结构域对纤维素的有效吸附,从而降低了酶与纤维素的可及度[20],导致酶解效率降低继而乙醇得率减少．

图3 发酵罐体系中未水洗物料预酶解48 h后调节pH至6.0进行半同步糖化共发酵各参数的变化情况Fig.3 Changes in the parameters during the semi-SSCFof un-washed materials after pre-enzymatic hydrolysis of48 h and adjusting pH to 6.0 in a fermentor system

2.3 水洗两步碱法预处理玉米秸秆半同步糖化共发酵

2.3.1 三角瓶体系

(1) 发酵pH 4.8时对半同步糖化共发酵的影响 水洗两步碱法预处理玉米秸秆先在pH 4.8、温度50 ℃、转速150 r/min的条件下预酶解48 h,然后取出降温至30 ℃左右,同时维持pH不变为4.8．加入OD600=6的树干毕赤酵母,充分混匀后,置于30 ℃、150 r/min的摇床中半同步糖化共发酵,其葡萄糖、木糖和乙醇的浓度随时间的变化如图4．

图4 三角瓶体系中未水洗物料预酶解48 h后维持pH 4.8进行半同步糖化共发酵各参数的变化情况Fig.4 Changes in the parameters during the semi-SSCFof washed materials after pre-enzymatic hydrolysis of 48 h and keeping pH at 4.8 in an Erlenmeyer flask system

从图4可以看出,预酶解前48 h随着时间的延长葡萄糖和木糖浓度不断增加,48 h时葡萄糖浓度和木糖浓度分别达到37.68和18.26 g/L．72 h时葡萄糖基本被利用完,90 h之后木糖也基本被利用完．随着葡萄糖和木糖不断被利用，乙醇浓度也在不断增加,90 h时达到最高值23.00 g/L,乙醇产率为0.287 g/g(以物料中纤维素和半纤维素含量计,下同)．文献[21]研究变温发酵对乙醇得率的影响,即41 ℃先发酵21 h后,35 ℃再发酵63 h时,乙醇产率最高为0.125 g/g,比恒温发酵的产率0.119 g/g要高．虽然通过改变发酵过程中温度乙醇产率得以提高,但由于糖化效果不理想使得最终乙醇产率提高并不明显．文中通过48 h的预酶解再降低温度进行戊糖、己糖共发酵,在总时间不变的情况下乙醇产率得到很明显的提高．文献[22]研究了酸预处理后的麦秆在50 ℃的条件下预酶解24 h后将温度降至37 ℃并加入相应的酿酒酵母,其乙醇产率为10.4(按100 g原料计),相当于0.286 g/g．文中通过变温发酵乙醇产率为0.287 g/g，与文献研究结果相当．

(2) 发酵pH 6.0时对半同步糖化共发酵的影响 水洗两步碱法预处理玉米秸秆先在pH 4.8、温度50 ℃、转速150 r/min的条件下预酶解48 h,然后取出降温至30 ℃左右,同时将pH调至6.0,接入OD600=6的树干毕赤酵母,充分混匀后,置于30 ℃、150 r/min的摇床中进行半同步糖化共发酵,其葡萄糖、木糖和乙醇浓度随时间的变化如图5．

图5 三角瓶体系中未水洗物料预酶解48 h后维持pH至6.0进行半同步糖化共发酵各参数的变化情况Fig.5 Changes in the parameters during the semi-SSCFof washed materials after pre-enzymatic hydrolysis of 48 h and adjusting pH to 6.0 in an Erlenmeyer flask system

从图5可以看出,预酶解前48 h随着时间的延长葡萄糖和木糖浓度不断增加,48 h时葡萄糖浓度和木糖浓度分别达到37.58和18.75 g/L．66 h时葡萄糖基本被利用完,90 h之后木糖也基本被利用完．随着葡萄糖和木糖不断被利用，乙醇浓度也在不断增加,84 h时达到最高值23.41 g/L,乙醇产率为0.292 g/g．相比于预酶解48 h之后维持pH4.8，乙醇产率和乙醇浓度都增加不明显．虽然乙醇产率和乙醇浓度增加不明显但发酵时间却缩短了,所以在后续发酵罐实验中采用在pH 4.8下先预酶解48 h，然后将pH调至6.0,同时接入酵母．文献[23]通过建模对酿酒酵母指出当pH从5.0升至6.0时,酵母的生长模式没有发生改变,而从5.0降至3.9时，其生长模式发生改变．所以在本实验中,对于水洗物料而言当pH由4.8升至6.0时,乙醇得率提高不明显．研究表明[24],在同步糖化发酵过程中当pH由4.5升至5.0时,乙醇产率由0.159 g/g提高至0.187 g/g．

2.3.2 发酵罐体系 为了更好地探寻半同步糖化的发酵规律,在3 L发酵罐中进行放大实验,并通过发酵罐自带的系统调控各发酵参数．根据之前的三角瓶实验结果,在发酵罐实验中,采取在pH 4.8下先预酶解48 h,然后将pH调至6.0,接入OD600=6的树干毕赤酵母进行半同步糖化共发酵．48 h之前不通气,48 h之后通气量为0.05 L/min．其葡萄糖、木糖和乙醇的浓度随时间的变化见图6．

从图6可以看出,预酶解前48 h随着时间的延长葡萄糖和木糖浓度不断增加,48 h时葡萄糖浓度和木糖浓度分别达到32.09和13.92 g/L．72 h时葡萄糖基本被利用完,90 h时木糖也基本被利用完．随着葡萄糖和木糖不断被利用，乙醇浓度也在不断增加,90 h时达到最高值18.85 g/L,乙醇产率为0.234 g/g．此后乙醇浓度开始下降,可能是因为葡萄糖和木糖的产生速率不及其消耗速率,酵母菌在饥饿状态下开始反耗产生的乙醇,还有可能是由于发酵罐底部不断通气经过发酵液,带走大量通过发酵产生的乙醇,导致发酵乙醇浓度和乙醇得率与摇瓶实验相比略有降低[13,22]．与未水洗物料相比乙醇得率虽有提高,但综合考虑可发现未水洗物料工艺简单,不经过固液分离,能减轻废水处理及废水污染问题,所以其应用前景较大．

图6 发酵罐体系中未水洗物料预酶解48 h后调节pH至6.0半同步糖化共发酵各参数的变化情况Fig.6 Changes in the parameters during the semi-SSCFof washed materials after pre-enzymatic hydrolysis of48 h and adjusting pH to 6.0 in a fermentor system

3 结论

(1) 以树干毕赤酵母为发酵菌株未水洗物料在pH 4.8下,预酶解48 h之后维持pH不变时,乙醇产率为0.193 g/g;预酶解48 h之后将pH调至6.0时乙醇产率为0.234 g/g,改变pH后乙醇产率得到很大提高;3 L发酵罐放大实验中乙醇产率为0.220 g/g．

(2) 以树干毕赤酵母为发酵菌株水洗物料在pH 4.8的条件下,预酶解48 h之后维持pH不变时,乙醇产率为0.287 g/g；预酶解48 h之后将pH调至6.0时乙醇产率为0.292 g/g,因此改变pH对乙醇产率影响不明显;3 L发酵罐放大实验中乙醇产率为0.234 g/g．虽然水洗之后的乙醇得率有所提高,但是相比于水洗之后的废水处理、水的消耗等问题，可以采取将预处理完的浆液进行直接发酵．