酶法制备草鱼皮胶原蛋白抗氧化肽的工艺优化

秦倩倩，吴琼英*，贾俊强

(1.江苏科技大学 生物技术学院，镇江 212018) (2.江苏科技大学 粮食学院，镇江 212004)

草鱼为雅罗鱼亚科草鱼属,俗称鲩鱼、黑青鱼和油鲩等,一般喜栖居于江河湖泊等水域的中下层和多水草区域,是我国主要淡水鱼之一,年产量达500万吨以上[1]．草鱼不仅肉质肥嫩,而且味道鲜美,除了作为鲜活产品零售外,常被用于生产鱼肉制品．鱼皮约占鱼体总重量的5%,是主要的下脚料之一,常被作为废弃物丢弃,造成资源的浪费．研究表明,鱼皮含有丰富的胶原蛋白,其中草鱼皮的胶原蛋白含量高达蛋白总量的80%以上[2],是一种优质的胶原蛋白资源.

胶原蛋白是一种螺旋形纤维状蛋白质,分子中氨基酸含量齐全,尤其脯氨酸含量最为丰富,其酶解产物具有抗氧化[3]、降血压[4]和提高免疫力[5]等生物活性,是酶法制备生物活性肽的理想蛋白原料．目前已有从草鱼皮胶原蛋白中制备生物活性肽的报道,如文献[6]利用胰蛋白酶制备得到的草鱼皮胶原蛋白肽具有抗氧化、降血压以及抗菌的生物活性；文献[7]利用木瓜蛋白酶制备的草鱼皮胶原蛋白肽具有抗氧化活性．超声波因操作简便、高效、促进酶解等优点已被广泛应用于生物活性肽的制备[8-9]．然而,目前尚未有利用超声辅助酶解法制备草鱼皮胶原蛋白抗氧化肽的研究报道．文中以酶溶性草鱼皮胶原蛋白为材料,以DPPH自由基清除率为评价指标,研究了底物浓度、加酶量、酶解温度、酶解时间和超声预处理等因素对酶解产物抗氧化活性的影响,以期为草鱼皮胶原蛋白的综合利用提供理论和技术支持．

1 实验

1.1 材料与设备

草鱼皮购自上海水产中心,切碎洗净,用10%正丁醇浸泡24 h脱脂,用0.01 mol/L NaOH(含3%NaCl)浸泡24 h去杂蛋白．洗净,用0.5 mol乙酸(含0.25%胃蛋白酶)浸提12 h,液料比30 ∶1．浸提液用0.9 mol/L NaCl盐析24 h,然后5 000 r/min离心30 min,取沉淀,用8 000～12 000 kDa的透析袋透析24 h,冻干,备用[10]．

1,1-二苯基-2基苯肼(DPPH)，Sigma公司;碱性蛋白酶(200 U/mg)、胃蛋白酶(3 000 U/mg)、木瓜蛋白酶(800 U/mg)、中性蛋白酶(100 U/mg)、胰蛋白酶(250 U/mg)，上海源叶生物科技有限公司;正丁醇、乙酸、氯化钠、无水乙醇、氢氧化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等分析纯，生工生物工程(上海股份)有限公司．

本实验采用Q700 型超声破碎仪，Qsonice公司.

1.2 酶解产物的制备

取获得的胶原蛋白粉,按试验设计配置不同浓度的胶原蛋白溶液,放入预设温度的水浴锅中,调节所需pH,加入蛋白酶,开始计时．酶解过程中不断加入0.1 mol/L NaOH维持酸碱度在所需pH,酶解结束后沸水浴10 min灭酶,再5 000 r/min离心30 min,取上清液,调节pH至7.0，所得即为酶法提取草鱼皮胶原蛋白酶解产物[11]．

1.3 DPPH自由基清除活性的测定

取2 mL样品于试管中,加入2 mL浓度为0.04 g/L的DPPH无水乙醇溶液,混匀,避光反应30 min,5 000 r/min离心10 min,取上清液,在517 nm测吸光值，记为A1.另取2 mL样品于试管中,加入无水乙醇2 mL,反应30 min,5 000 r/min离心10 min,取上清液，在517 nm测吸光值，记为A2.以2 mL 0.04 g/L DPPH无水乙醇溶液和2 mL无水乙醇反应为参比,其吸光值记为A0．按式(1)计算待测样品对DPPH自由基的清除率Y[12]:

Y=[1-(A1-A2)]/A0×100%

(1)

1.4 酶解用酶的筛选

以DPPH自由基清除率为指标,从碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶5种蛋白酶中筛选酶解用酶,筛选条件见表1.

表1 5种蛋白酶酶解条件

1.5 胶原蛋白酶解工艺优化实验

1.5.1 采用Design-Expert进行Plackett-Burman(PB)试验

通过PB试验[13]筛选胶原蛋白酶解工艺中对DPPH自由基清除率影响较大的主因素．各因素及编码水平设计见表2．

1.5.2 最陡爬坡试验

按照PB试验筛选出的对DPPH自由基清除率影响显著的因素,以各因素效应的正负、大小分别确定爬坡方向和变化步长,从而迅速逼近最大响应值．最陡爬坡试验除去影响显著因素,其他各因素均保持不变．

表2 胶原蛋白酶解条件优化的Plackett-Burman

1.5.3 Box-Behnken试验

依据PB试验确定的对DPPH自由基清除率影响显著的因素,结合最陡爬坡试验结果,确定Box-Behnken试验各因素水平的中心点及步长[14]．试验设计及数据分析借助Design-Expert 7. 1. 6 软件进行,Box-Behnken试验设计因素及编码水平见表3．

表3 胶原蛋白酶解条件优化的Box-Behnken

1.6 超声预处理对草鱼皮胶原蛋白酶解产物DPPH自由基清除率的影响

以未处理的胶原蛋白为对照,研究胶原蛋白超声10 min时,不同超声功率(50、100、150、200、250 W)对胶原蛋白酶解多肽DPPH自由基清除率的影响,并在最优超声功率下研究不同超声时间(5、10、15、20、25 min)对胶原蛋白酶解多肽DPPH自由基清除率的影响．其他酶解条件选用中心组合试验确定的最优条件．

1.7 超声预处理对酶法提取草鱼皮胶原蛋白水解度的影响

以未处理的胶原蛋白为对照,研究胶原蛋白超声10 min时,不同超声功率(50、100、150、200、250 W)对胶原蛋白水解度的影响,并在最优超声功率下研究不同超声时间(5、10、15、20、25 min)对胶原蛋白水解度的影响．其他酶解条件选用中心组合试验确定的最优条件．

水解度测定选用pH-stat滴定法[15],计算公式见式(2)．

(2)

2 结果与分析

2.1 酶解用酶的筛选

由图1可见,碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶酶解产物的DPPH自由基清除率分别为55%、50.0%、47.6%、36.4%和34.9%,图中字母a-e表示存在差异显著(P<0.05).由图可看出，碱性蛋白酶酶解产物的DPPH自由基清除效果最好，这可能是因为草鱼皮胶原蛋白中含有较多的碱性蛋白酶酶切位点,酶切后产生了更多的活性肽——抗氧化肽．因此选用碱性蛋白酶作为草鱼皮胶原蛋白的酶解用酶．

图1 5种蛋白酶酶解多肽的DPPH自由基清除率Fig.1 DPPH free radical scavenging rate of five protease hydrolyzed peptides

2.2 Plackett-Burman试验设计筛胶原蛋白酶解工艺的主要影响因素

以DPPH自由基清除率Y为指标,对pH(X1)、酶解温度(X2)、酶解时间(X3)、加酶量(X4)、底物浓度(X5)等5个因素进行全面考察,并等距插入2个虚拟变量(N1、N2),每个因素各设高(1)、低(-1)2个水平,共12组.PB试验设计与结果见表4．加酶量为低水平(编码2、3、7、8、9和12)时,酶解产物DPPH自由基清除率平均为53.8%,明显低于高水平组(编码1、4、5、6、10和11)的平均值57.4%,这说明加酶量对酶解产物的DPPH自由基清除率有较大影响,且在一定范围内对其有促进作用．实验方差分析(表5)表明PB试验回归模型P<0.05,说明模型差异显著,具有统计学意义;各因素对PPH自由基清除率影响作用依次为加酶量>温度>酶解时间>pH>底物浓度．从表5可以看出,加酶量、酶解时间、温度对酶解产物的DPPH自由基清除率具有显著影响(P<0.05),pH和底物浓度对DPPH自由基清除率影响不显著(P>0.05)[13],因此试验中确定pH为8、底物浓度为1%进行后续试验．

表4 胶原蛋白酶解条件优化的Plackett-Burman试验设计与结果

表5 胶原蛋白酶解条件优化的Plackett-Burman试验结果的方差分析

注：**表示极显著(P<0.01),*表示显著(P<0.05)

2.3 最陡爬坡实验分析胶原蛋白酶解的最佳条件

通过PB试验筛选出显著影响因素,再根据各因素的效应大小、比例和变化方向进行最陡爬坡试验设计．对已筛选出的酶解温度(X1)、酶解时间(X2)和加酶量(X3)进行最陡爬坡设计试验[16],结果见表6，从表中可发现第4组条件下的酶解产物DPPH自由基清除率最高,因此最佳条件在此附近．

表6 胶原蛋白酶解条件优化的最陡爬坡试验设计与结果

2.4 Box-Behnken试验构建胶原蛋白酶解工艺条件优化的回归模型

采用Design-Expert8.0.6.1软件,进行3因素3水平的Box-Behnken试验设计，结果见表7．方差分析(表8)表明,此模型极显著(P<0.01),系数R2为0.961 3>0.95,模型失拟项P=0.301 1>0.05,不显著,说明模型拟合度良好[17]．从表7可以看出,各因素对胶原蛋白酶解产物DPPH自由基清除率的影响依次为:A(酶解时间)与B(酶解温度)相同,与PB试验结果基本一致,但略大于C(加酶量),可能是因为中心组合试验中的加酶量步长变小引起的．此外A2、B2、C2、以及AC对Y值影响显著(P<0.05),其余项不显著(P>0.05),说明各因素对响应值不是简单的线性关系．

Design-Expert 8.0.6.1拟合后得到胶原蛋白酶解产物对DPPH自由基清除率(Y)关于自变量A(酶解时间)、B(酶解温度)和C(加酶量)的回归方程:

Y=79.23-1.98A-2.19B-0.34C-2.55AB+2.20AC-1.83BC-3.75A2-2.68B2-0.68C2，由回归方程可以看出,方程的2次项系数均为负值,可知该回归方程的响应曲面开口朝下,因而存在极值点,可通过回归方程确定最优的酶解条件．

通过Design-Expert 8.06.1软件分析回归方程，得到草鱼皮胶原蛋白最优酶解条件为： 酶解时间3.0 h,酶解温度46.5 ℃,加酶量7 025.2 U/g,在该条件下DPPH自由基清除率最高,且最高可达78.0%．经3次验证试验,测定DPPH自由基清除率分别为77.6%、78.0%和78.9%,平均值为78.3%,和预测值78.0%十分接近,说明结果重现性良好,模型可靠,具有实用参考价值．

表7 胶原蛋白工艺条件优化的Box-Behnken

表8 胶原蛋白酶解工艺条件优化的Box-Behnken试验结果的方差分析

注：**表示极显著(P<0.01),*表示显著(P<0.05)

2.5 超声预处理对胶原蛋白酶解多肽的DPPH自由基清除率的影响

图4、5分别为不同超声功率和超声时间预处理对草鱼皮胶原蛋白酶解多肽的DPPH自由基清除率的影响.从图中可看出，超声对DPPH自由基清除率的影响呈现先升高后降低的趋势,低功率、短时间蛋白质结构变化不大,对DPPH自由基清除率的影响有限,功率过大、时间过长时体系温度上升,空化作用减弱,蛋白质会重新聚成集体,溶解性降低,同时,蛋白的酶切位点可能会包埋起来,减少了与酶的接触机会,从而酶解效果降低.因此,试验中选用超声功率100 W、超声时间10 min，与文献[18]研究结果类似．在此条件下，酶解产物DPPH清除率比未处理的提高了14.9%.

图4 不同超声功率预处理对草鱼皮胶原蛋白酶解多肽的DPPH自由基清除率的影响Fig.4 Effect of different ultrasonic power pretreatment on DPPH free radical scavenging rate of collagen proteolytic peptide of grass skin

图5 不同超声时间预处理对草鱼皮胶原蛋白酶解多肽的DPPH自由基清除率的影响Fig.5 Effect of different ultrasonic time pretreatment on DPPH free radical scavenging rate of collagen proteolytic peptide of grass carp skin

2.6 超声预处理对胶原蛋白水解度的影响

图6、7分别为不同超声功率和预处理时间对草鱼皮胶原蛋白水解度的影响.从图中可发现，不同超声预处理时间和功率对胶原蛋白水解度的影响具有相同趋势,均随着它们的增大呈现先增大后减小的趋势[19],在超声处理时间为10 min、功率为100 W时,水解度增幅最大,可从未处理的50.0%上升到60.3%,比未处理的提高20.6%．当超声功率过大(>100 W)或超声时间过长时(>10 min)，水解度开始缓慢下降,这可能是短时间或低功率下超声的机械波能使蛋白的颗粒细化[20],增加了酶与底物的接触面积；但当超声时间过长或功率过大时,声波累积的热效应使蛋白发生了聚集性折叠,导致溶解度下降,酶与底物的接触面积减少,不利于反应进行[21]．

图6 不同超声功率预处理对草鱼皮胶原蛋白水解度的影响Fig.6 Effect of different ultrasonic power pretreatment on the hydrolysis degree of grass skin collagen

图7 不同超声时间预处理对草鱼皮胶原蛋白水解度的影响Fig.7 Effect of different ultrasonic time pretreatment on the hydrolysis degree of collagen in grass carp skin

3 结论

本研究筛选出了碱性蛋白酶是制备草鱼皮胶原蛋白抗氧化肽的最佳蛋白水解酶,确定了酶解时间、酶解温度和加酶量对酶解产物的抗氧化活性具有显著影响;在最陡爬坡试验的基础上,利用Box-Behnken中心组合试验设计优化出最优酶解条件为:酶解时间3.0 h、酶解温度46.5 ℃和加酶量7 025.2 U/g,在此条件下,草鱼皮胶原蛋白酶解产物对DPPH自由基清除率可达78.3%,为理论值的100.4%．在最优酶解条件的基础上,利用超声预处理优化出了超声辅助酶解的最佳条件为:超声时间10 min、超声功率100 W,在此条件下,酶解产物DPPH自由基清除率比未处理的提高了14.9%左右，水解度提高了20.6%．

综上所述,超声预处理能够有效提高草鱼皮胶原蛋白酶解产物的抗氧化活性．文中研究结果为草鱼皮的深加工提供了技术支持．