4种肉类成分多重PCR的鉴定方法

袁淑辉 ， 蔡 军 ， 王忠才 ， 李 舟 ， 王建昌 ， 王素华

(1.温州海关综合技术服务中心 ， 浙江温州325027 ； 2. 石家庄海关技术中心 ， 河北石家庄050051)

肉类食品安全是世界范围内面临的共同问题，2014年欧洲暴发的“马肉风波”揭露了多国肉制品的掺假现象。不法商家在利益驱使下，在肉制品生产和消费过程中，利用以假乱真、以次充好等手段欺骗消费者而牟取暴利的事件屡屡出现，严重扰乱了市场秩序，侵害了生产者和消费者的合法利益，并涉及少数民族的宗教信仰，同时带来了严重的食品安全隐患。传统的肉种类鉴定主要依靠感官和经验，通过辨别肉制品的味道和色泽，在显微镜下观察肉的纹理等方法对肉类进行鉴别。但是传统的鉴别方法只适用于生鲜肉类，且需要丰富的经验，鉴别过程极具主观性，已无法满足对肉制品掺假现象进行控制与监管的需要[1]。因此，对于居民消费量大、肉制品市场占有率较高的牛肉、猪肉、鸡肉以及曾被掺假使用的马肉，建立准确、快速、高通量的鉴定方法已十分必要[2]。

以基因组DNA为研究对象的PCR扩增技术已经成为肉类种属鉴定的核心方法[3-5]。许多国内外学者根据不同物种的基因序列设计特异性引物，利用PCR反应实现特异性基因片段的指数级扩增，通过凝胶电泳条带或荧光曲线鉴别食品中可能的物种来源[6-8]。本试验基于牛、猪、鸡和马线粒体细胞色素b基因设计了1条通用正向引物F ； 以牛、猪、鸡和马的特定DNA序列为研究对象，设计了4条特异性反向引物，建立了牛、猪、鸡和马4种肉类成分通用引物的多重PCR方法。

1 材料与方法

1.1 材料 以市售合格的牛、猪、鸡、马、羊、鸭、鸽、鹌鹑以及兔肉为试验材料，各物种肉样分别搅碎后-20 ℃ 保存，避免交叉污染。

1.2 主要试剂 Quick-DNATM提取和纯化试剂盒，购自Zymo Research公司；TaqDNA聚合酶(5 U/μL)、dNTPs(10.0 mmol/L)、MgCl2(25 mmol/L)、DL-5 000 DNA Marker，均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 用Quick-DNATM提取和纯化试剂盒提取1.1中的肉类总DNA，总DNA样品溶于TE缓冲液中，于-20 ℃保存备用。

1.3.2 引物设计与合成 依照Matsunaga等[9]推荐的方法设计牛、猪、鸡和马线粒体细胞色素b基因的特异性引物，根据牛、猪、鸡和马线粒体细胞色素b基因序列设计正向通用引物CF；根据牛、猪、鸡、马的种属特异性DNA序列设计专属的反向引物。引物扩增长度和序列见表1。引物由上海华大基因科技有限公司合成。

表1 引物序列及扩增片段长度Table 1 Primer sequence and amplification length

1.3.3 多重PCR的反应条件及优化 在50 μL多重PCR反应体系中分别进行牛肉、猪肉、鸡肉和马肉4种肉类的鉴别。反应体系：10×PCR Buffer 5.0 μL， dNTPs(10.0 mmol/L)1.0 μL，MgCl2(25 mmol/L)2.0 μL，CF、牛-R、猪-R、鸡-R、马-R(10 mmol/L)各1.0 μL，稀释至10 ng/μL的DNA模板2.0 μL，加灭菌去离子水至50.0 μL。反应条件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，55～60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 35个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃结束反应。用2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

1.3.4 特异性试验 按照1.3.3中的反应体系及优化的反应条件，分别使用牛肉、猪肉、鸡肉和马肉4种肉类DNA及两两等比例混合DNA和羊肉、鸭肉、鸽肉、鹌鹑肉和兔肉的DNA对引物的检测特异性进行验证。

1.3.5 敏感性试验 将浓度为10 ng/μL的4种目标肉类DNA 10倍梯度稀释，使用1.3.3的反应体系及优化的反应条件，分别针对牛肉、猪肉、鸡肉和马肉4种肉类验证多重PCR方法的灵敏度。

1.3.6 多重PCR方法检测混合样品 应用1.3.3中建立的方法对混合肉样进行PCR扩增，反应时分别加入1种、2种、3种和4种肉样DNA的混合物，进行多重PCR检测。

1.3.7 市售样本的检测 应用建立的多重PCR检测方法对市场采购的8类共80个不同的牛肉制品进行鉴定，并与实验室常用的荧光定量PCR试剂盒鉴定结果进行比较，验证方法的准确性应用价值，并了解市场上肉类掺假的真实情况。

2 结果

2.1 模板DNA质量 用核酸蛋白分析仪测定提取的基因组DNA的浓度和纯度，所测OD260 mm/OD280 mm值在1.8～2.1，浓度为130～180 ng/μL，从样品中提取的DNA无论是浓度还是纯度都较高，能满足后续PCR扩增试验的需要。

2.2 多重PCR反应条件优化 通过退火温度的梯度PCR试验，结合PCR扩增的特异性与产物量，确定最佳退火温度为60 ℃。使用1.3.3中的方法扩增的牛肉、猪肉、鸡肉和马肉4种肉类DNA片段长度分别为274 bp，394 bp，221 bp和433 bp，结果见图1。

图1 4种肉类PCR产物凝胶电泳图Fig.1 Gel electrophores is of PCR products of four kinds of meatM: DL-5 000 DNA marker; 1：马肉； 2：牛肉； 3：猪肉； 4：鸡肉M: DL-5 000 DNA marker; 1:Horse; 2:Beef; 3:Pork; 4: Chicken

2.3 引物特异性验证 分别使用4种目标肉类的单一种类DNA和两两等比例混合DNA及羊肉、鸭肉、鸽肉、鹌鹑肉和兔肉的DNA对引物的检测特异性进行验证与比较，结果见图2。对牛肉、猪肉、鸡肉和马肉4种肉类的单一种类和两两混合DNA进行检测，均能在设计位置观察到特异性条带，未见非特异性扩增，且与羊肉、鸭肉、鸽肉、鹌鹑肉和兔肉的DNA均无交叉反应。

图2 多重PCR特异性试验Fig.2 Specificity results of multiplex PCRM: DL-5 000 DNA marker; 1：马肉； 2：牛肉； 3：猪肉； 4：鸡肉； 5：马肉和牛肉； 6：马肉和猪肉； 7：马肉和鸡肉； 8：牛肉和猪肉； 9：牛肉和鸡肉； 10：猪肉和鸡肉； 11：羊肉； 12：马肉、牛肉和鸡肉；13：马肉、猪肉和鸡肉； 14：鹌鹑肉； 15：兔肉M: DL-5 000 DNA marker; 1：Horse； 2：Beef； 3：Pork； 4：Chicken；5：Horse and beef； 6：Horse and pork； 7：Horse and chicken； 8：Beef and pork； 9：Beef and chicken； 10：Pork and chicken； 11：Ovine； 12：horse, beef and chicken； 13：horse, pork and chicken； 14：Quail； 15：Rabbit

2.4 敏感性试验 将10 ng/μL的牛、猪、鸡和马肉DNA模板进行10倍梯度稀释，使用1.3.3中的反应体系及优化的反应条件，针对上述4种肉类DNA验证多重PCR方法的灵敏度，结果见图3。由图3可见，4种肉类DNA各至稀释10-3后，使用多重PCR方法进行检测，仍能观察到微弱的特异性条带；目标DNA稀释至10-4后进行多重PCR扩增，不能观察到特异性条带。因此，检测的灵敏度可达到10×10-3ng/μL。

图3 多重PCR敏感性试验Fig.3 Specificity results of multiplex PCRM: DL-5 000 DNA marker; H：马肉； B：牛肉； P：猪肉； C：鸡肉M: DL-5 000 DNA marker; H：Horse； B：Beef； P：Pork； C：Chicken

2.5 混合肉样检测 用建立的多重PCR快速检测方法，分别以牛、猪、鸡和马肉的DNA为模板，按照1.3.3中优化的反应条件进行多重PCR检测，4种肉类的单一种类DNA、2种、3种及4种DNA等比混合物均能得到有效鉴别，结果见图4。

图4 混合肉样检测结果Fig.4 Results of mixed meat samplesM: DL-5 000 DNA marker; 1：马肉； 2：牛肉； 3：猪肉； 4：鸡肉； 5：牛肉和鸡肉； 6：猪肉和鸡肉； 7：马肉和鸡肉； 8：马肉和牛肉； 9：猪肉和牛肉； 10：马肉和猪肉； 11：牛肉、猪肉和鸡肉； 12：马肉、牛肉和鸡肉； 13：马肉、猪肉和鸡肉；14：马肉、牛肉和猪肉； 15：马肉、牛肉、猪肉和鸡肉； 16：阴性对照M: DL-5 000 DNA marker; 1：Horse； 2：Beef； 3：Pork； 4：Chicken； 5：Beef and chicken； 6：Pork and chicken； 7：Horse and chicken；8：Horse and beef； 9：Pork and beef； 10：Horse and pork； 11： Pork, beef and chicken； 12：Horse, beef and chicken； 13：Horse, pork and chicken； 14：Horse, pork and beef； 15：Horse, pork, beef and chicken； 16：Negative control

2.6 市售肉制品检测 应用建立的多重PCR方法对市场采购的8种80个不同牛肉制品进行掺假鉴定，判定与所贴标签是否相符，同时验证所建立的多重PCR检测方法推广使用的可行性。鉴别结果见表2，由表2可知，部分牛肉产品存在一定的掺假和食品安全问题。混合引物能够扩增出多种肉类相应的特异性条带，能准确鉴定出几种常见的动物源性成分，经过热加工的肉制品扩增条带仍然十分清晰。多重PCR与商品化荧光定量PCR检测试剂盒对80个不同牛肉制品掺假的检测结果基本吻合，只对一组10个样品的盒装牛肉片检测结果有差异，荧光定量PCR检测试剂盒比多重PCR的检出率高10%，这可能是由于掺入量少，多重PCR未能检出。牛、猪、鸡、马肉等常见肉食品的种类在日常检测鉴定中占很大比重，此方法可作为政府检验部门对肉制品的常规检测，用于肉类真伪鉴别和掺假成分的判断。

表2 实际样品检测结果Table 2 Results for market samples

3 讨论

近年来，随着分子生物学检测技术的不断发展，逐步形成了以核酸检测为基础的鉴定体系。在鉴定动物源性成分的过程中，多重PCR技术可通过一次扩增同时检测多个靶标基因，弥补了普通PCR在肉制品掺假检测中的不足，成为常见的鉴定方法之一。本试验在参考前人研究的基础上[10-11]，基于牛、猪、鸡和马的特定基因，建立了快速检测4种肉类成分的多重PCR方法。采用正向引物通用、反向引物特异的设计策略，应用包含5条引物的多重PCR体系实现4个物种的鉴定，尽量控制引物数量过多引起的交叉干扰。经引物序列和反应体系优化，建立的多重PCR具有较高的敏感性和特异性。相比于普通PCR和实时荧光定量PCR技术对动物源性成分的鉴定，本试验具有检测仪器简单、检测成本低、检测通量高等优点，更适合于对大量肉制品掺假的鉴别筛选。

近年来曝光的肉制品掺假主要是使用售价较低的猪肉、鸡肉和马肉等掺入到售价较高的牛肉和羊肉中。本试验针对可能出现的掺假肉类种类，筛选出保守性强的在牛、猪、鸡、马物种特异性基因，并验证了其特异性和敏感性。建立的多重PCR反应体系对于同时鉴定目标肉类中的2种、3种或4种成分都具备良好的效果。对80份以牛肉为主的市售样品进行掺假鉴别，可敏感、特异、准确的检出牛肉制品中掺入的猪、马、鸡成分。

本试验建立了敏感性高、特异性强的4种肉类成分多重PCR鉴定方法，该方法可有效缩短和简化肉制品掺假鉴定的步骤，比普通PCR技术提高了检测通量，比实时荧光PCR技术节约了检测成本。