老年和青年SD大鼠外周血及免疫细胞分型测定分析

管博文，卢延华，石桂英，苏路路，王玉全，王 卫，魏 强，白 琳，孟爱民

(中国医学科学院医学实验动物研究所，北京协和医学院比较医学中心，国家卫生健康委员会人类疾病比较医学重点实验室，北京市人类重大疾病实验动物模型工程技术研究中心，北京 100021)

中国是世界上老年人口最多的国家，给当今社会和经济发展带来了巨大挑战。在老龄化过程中机体稳态平衡被打破，身体各系统机能不断减退，成为各种老年病的重要危险因素，严重影响老年人的生活质量。衰老有很多种理论，包括自由基损伤，端粒酶缩短，DNA损伤和免疫衰老等。其中免疫衰老学说的核心观点是机体衰老是免疫衰老，神经衰老，内分泌紊乱共同导致的。机体的衰老导致免疫器官的萎缩，进一步导致淋巴细胞功能的下降，对应激的应答减弱，反过来导致机体的进一步衰老。神经细胞和免疫细胞有相同的细胞因子受体，存在着相互作用，神经系统的衰老也会导致内分泌系统的紊乱，最终导致整个机体的衰老加快[1-3]。

相比低等动物，啮齿类动物在身体结构功能上和基因上都与人更加接近，其中大鼠在神经，毒理和代谢上更接近人类，有利于未来制作基因修饰的早衰大鼠模型[4-5]。所以本文选用老年大鼠检测外周血、脾免疫细胞分型及免疫细胞衰老指标，并与对青年大鼠进行比较分析。进一步分析各项指标的性别差异，为研究老龄化改变及老年病提供基础数据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级青年SD大鼠，8周龄，共10只，雌雄各半，雄性体重265～285 g，雌性体重199～205 g；SPF级12月龄SD雄性大鼠10只，体重720～970 g，雌性大鼠10只，体重范围360～490 g。SD大鼠均购于北京华阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2014-0004]。青年与老年大鼠均饲养于中国医学科学院医学实验动物研究所动物房屏障环境[SYXK(京)2015-0035]，温度为20℃～26℃，内外压差大于10帕斯卡，相对湿度为40%～70%，12 h进行一次昼夜交替，照明强度为15～20勒克斯，动物自由取食饮水。本实验经过中国医学科学院医学实验动物研究所IACUC的批准，批准号为MAM17001。并依照实验动物伦理和福利要求使用实验动物。

1.2 主要试剂与仪器

流式抗体CD25-PE、CD3-FITC购于eBioscience；CD8 PE-Cy7、Mac-PE购于Thermofisher scientific；CD4-APC、CD161-FITC、CD45RA-APC、CD3-FITC、CD45RA-APC购于BioLegend；红细胞裂解液购于Invitrogen公司；EasySepTMRat T Cell Isolation Kit购于STEMCELL Technologies；大鼠脾单个核细胞分离液试剂盒由索莱宝提供；外周血计数及分类由全自动血液分析仪PentraDX120(ABX)分析；血细胞免疫分型应用BD流式分析仪(BD FACSAria II)检测。

1.3 实验方法

1.3.1 外周血细胞计数及分类

大鼠称重腹腔注射2%戊巴比妥钠，麻醉后腹主动脉取血，医用抗凝采血管收集，用于外周血计数及白细胞分类。取血后安乐死[6]。

1.3.2 免疫脏器系数

大鼠安乐死后，取胸腺、脾和大脑分别称重，计算胸腺系数和脾系数。胸腺系数=胸腺重量(g)/大鼠大脑重(g)，脾系数=脾重量(g)/大鼠大脑重(g)[7-8]。

1.3.3 外周血免疫细胞和脾淋巴细胞分型检测

将大鼠脾研磨制备脾细胞悬液。取一定量脾悬液和外周血分别加入红细胞裂解液室温裂解8 min，加入PBS终止裂红，并离心洗涤一次，离心条件为400 g，4℃，5 min。弃上清重悬加入对应抗体4℃孵育。PBS洗涤并重悬，离心条件同上。用流式细胞仪分别进行外周血和脾淋巴细胞的免疫分型检测[9]。

1.3.4 脾T细胞分离及P16 mRNA表达量检测

利用试剂盒采用密度梯度离心法分离大鼠脾单个核细胞、免疫磁珠法富集T细胞。具体步骤如下：取适量脾细胞悬液体积调节为3 mL，缓慢加到ficoll分离液上，室温1500 r/min离心25 min。离心后取单个核细胞层，用不含钙镁Hank’s液洗涤2次。用含有2%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和1 mM EDTA的PBS重悬并计数，将浓度调节为每毫升5×107个。在样品中按50 μL/mL加入Cocktail混合抗体，混匀，室温孵育10 min。孵育结束后在样品中按50 μL/mL加入磁珠(RapidSpheres),并加入含2% FBS和1mM EDTA的PBS补齐至5 mL。放入磁铁分离器中孵育，室温10 min。孵育后其他细胞被磁珠包被吸附在管壁，细胞悬液中为T细胞。收集细胞悬液，离心重悬计数，按每1×106～5×106个细胞加入1 mL TRIzol保存，由上海欧易生物医学科技有限公司采用RT-qPCR检测P16 mRNA表达量[10]。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 外周血计数及分类

外周血计数结果显示，与青年大鼠相比，老年大鼠白细胞计数降低(降低28.7%，P<0.05)，红细胞计数、血红蛋白含量升高(分别为P<0.01，P<0.05)。分类结果显示淋巴细胞百分比下降(降低18.8%)；粒细胞百分比、嗜酸性粒细胞百分比和嗜碱性粒细胞百分比升高(分别升高40.2%、104.4%和28.9%，P<0.01、P<0.01和P<0.05)；血小板和单核细胞百分比未见差异。提示了老年大鼠淋系和粒系细胞分化偏移。结果如表1所示。

2.2 免疫脏器系数

由于老年大鼠与青年大鼠、两组大鼠不同性别之间体重有明显差异，常规的脏器系数(脏器/体重比)无法真实的反映脏器的变化，故免疫脏器系数以大鼠胸腺、脾重量与大脑重量比表示[8]。分析结果显示，老年组与青年组大鼠胸腺指数和脾指数未见显著性差异。结果见图1。

表1 老年大鼠与青年大鼠外周血计数比较

注：与青年大鼠相比，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with young rat，*P<0.05，**P<0.01.

2.3 外周血免疫分型

流式细胞术检测外周血辅助T细胞(CD4)、调节性T细胞(CD4 CD25)、细胞毒性T细胞(CD3 CD8)、B细胞、自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)和单核细胞，各种细胞分析门的设置见图2。

流式结果显示，与青年大鼠比较，老年组大鼠的辅助T细胞、调节性T细胞、自然杀伤细胞和单核细胞升高，B细胞降低，细胞毒性T细胞未见明显差异。相较于青年组，老年组辅助T细胞从(32.34 ± 1.93)%上升到(39.67 ± 1.75)%(P<0.05)；老年组调节性T细胞从(2.30 ± 0.42)%上升到(6.58 ± 0.93)%，(P<0.01)；老年组自然杀伤细胞从(3.02 ± 0.36)%上升到(6.21 ± 0.66)%(P<0.01)，老年组单核细胞从(0.43 ± 0.11)%上升到(1.00 ± 0.15)%(P<0.05)；相较于青年组，老年组B细胞从(39.14 ± 2.30)%下降到(31.50 ± 1.88)%(P<0.05)。细胞毒性T细胞未见明显差异，见图3。

2.4 脾免疫细胞分型

流式细胞术分析脾淋巴细胞CD3+和CD45RA+比例。见图4。

结果显示，与青年组相比，老年组CD3细胞比例未见明显差异，CD45RA从(46.42 ± 3.65)%降低到(38.69 ± 5.52)%，差异有极显著性(P<0.01)。结果见图5。

2.5 脾T细胞P16 mRNA表达量检测

为了检测老年大鼠T淋巴细胞P16 mRNA表达量的改变，分离T细胞，RT-PCR检测P16 mRNA表达量。结果显示，相比于青年雄性大鼠，老年雄性大鼠P16 mRNA表达量明显升高，从1.03±0.28上升到4.74±2.05(P<0.05)。结果见图6。

图1 老年大鼠与青年大鼠免疫脏器系数比较Figure 1 Comparison of organ coefficient between aged and young rat

图2 外周血细胞流式分析门的设置及示意图Figure 2 Representative gating strategy for peripheral blood immune cell phenotypes analyzed by flow cytometry

注：与青年大鼠相比，*P<0.05，**P<0.01。图3 老年大鼠与青年大鼠外周血免疫细胞分型比较Note. Compared with young rat，*P<0.05，**P<0.01.Figure 3 Comparison of immune cell typing in peripheral bloodbetween aged and young rat

图4 流式分析脾免疫细胞门的设置及示意图Figure 4 Representative gating strategy for splenicimmune cell phenotypes analyzed by flow cytometry

注：与青年大鼠相比，**P<0.01。图5 老年大鼠与青年大鼠脾免疫细胞分型比较Note. Compared with young rat，**P<0.01.Figure 5 Comparison of splenic immune cell typing between aged and youngrat

注：与青年雄性大鼠相比，**P<0.01。图6 老年雄性大鼠和青年雄性大鼠脾T细胞的P16 mRNA表达比较Note. Compared with young male rat,**P<0.01.Figure 6 Comparison of P16 mRNA expression in splenic T cells between agemalerat and young male rat

3 讨论

本研究对老年大鼠外周血计数、免疫细胞分型、脏器系数以及T细胞P16表达水平进行检测，并与青年大鼠进行比较分析。

老年大鼠外周血检测结果显示白细胞减少，红细胞升高；淋巴细胞比例减低，中性粒细胞、嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞比例升高，提示老年大鼠天然免疫功能下降，淋系与髓系比例发生改变出现，分化偏移，变态反应性增强，与老年人出现的改变类似。与研究人员前期检测老年小鼠的结果相同[9]。而在林洪燕和张海洁等[11-12]的研究中，老年人群外周血红细胞和血红蛋白都是趋于降低。胡雄飞等[13]的研究中，相较于青年大鼠，老年大鼠只有白细胞和血红蛋白是升高的，其余各项均无显著性差异。李长雷的研究中，则是红细胞，中性粒细胞百分比，嗜碱性粒细胞百分比和单核细胞百分比上升，血小板，淋巴细胞百分比下降[14]。老年大鼠外周血的变化测定结果不一致，可能与测定实验室条件不同有关，但老年大鼠外周血白细胞计数下降、淋巴细胞比例降低、中性粒细胞比例升高的结果比较一致。这可能与老年人易出现髓系白血病有关[15]。

外周血免疫分型中，老年组大鼠T细胞比例升高，B细胞比例明显下降，CD4/CD8比例升高，调节T细胞显著升高；B细胞下降与脾淋巴细胞分型检测结果一致，提示老年大鼠在白细胞降低、淋巴细胞比例下降的基础上，中枢淋巴器官和外周血B细胞水平降低，可能与老年人接种疫苗免疫反应性下降，抗感染能力降低有关[16]。但这与课题组前期研究发现老年小鼠外周血仅有CD4比例降低不同[9]。

调节性T细胞通过主动调节的方式抑制存在于正常机体内潜在的自身反应性T细胞的活化与增殖，防止自身免疫性疾病的发生；测定结果发现，老年大鼠调节T细胞比例升高，则可能与老年人出现免疫抑制，免疫监视功能下降，肿瘤高发及转移有关[17]。今后还要进一步确认这是否为老年SD大鼠的特有的T细胞表型改变。

检测结果显示老年组大鼠的NK细胞和单核细胞比例有明显升高。这是在外周血白细胞比例下降的基础上的升高，还需进一步检测NK细胞和单核细胞功能，探讨这种改变的临床意义。在于昉等[18]的研究中，老年人NK细胞的比例没有明显变化，但是在NK细胞毒活性明显降低。邓宪等[19]的研究中，老年人单核细胞数上升，与青年人群中单核细胞上升意义不同，在老年人群中可能代表机体衰老和凋亡细胞增多，单核细胞反应性升高。

P16由p16INK4a基因编码的细胞周期抑制剂，也是一种肿瘤抑制蛋白[20]。研究人员发现老年雄性大鼠脾T细胞P16 mRNA表达明显高于青年雄性大鼠。老年小鼠中除了脾之外，在脑、心脏、肺和睾丸中也有明显升高[21]。老年人T细胞p16INK4a的表达量随年龄的增长呈指数增长[22]。在Melk等[23]的研究中显示，人肾脏皮层按照年龄分为青年，成年和老年三组，P16的表达量与增龄成正相关。本文与两个研究结果一致。同时也有文章报道，B淋巴细胞的衰老是由p16INK4a和Arf介导的[24]。在Krishnamurthy等[25]研究认为Ink4a的表达可以作为一种衰老标志物。在Wood等[26]的研究中用T细胞P16表达作为化疗和干细胞移植患者的干细胞功能和治疗效果的生物学检测指标。

本文对不同年龄段的大鼠进行外周血和免疫细胞分型测定分析，并与老龄人群进行比较医学分析，验证了老年大鼠衰老标志物p16INK4a升高，初步表明增龄对大鼠免疫系统产生了巨大的影响，为研究免疫衰老及老年病提供基础数据。