烟粉虱MED隐种钙离子结合蛋白基因的RNAi及其生物学效应

郭 磊, 潘正元, 刘佳茵, 韩铭轩, 褚 栋

(青岛农业大学植物医学学院, 山东省植物病虫害综合防控重点实验室, 山东青岛 266109)

烟粉虱Bemisiatabaci是一种世界性分布的重要农业害虫。该虫能通过取食对植物直接造成危害(De Barroetal., 2011)，还可以作为病毒媒介昆虫传播近200种植物病毒(Navas-Castilloetal., 2011)，其中包括具有毁灭性的植物病毒——番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)(Scholthofetal., 2011)以及近年来在国内流行的番茄褪绿病毒(tomato chlorosis virus, ToCV)(郑慧新等, 2016)。烟粉虱是一个含有许多隐种的复合种，目前全世界至少包括44个烟粉虱隐种(Kanakala and Ghanim, 2019)。这些隐种在形态上难以区分，但在生物学特性(例如繁殖力、寄主范围等)上均存在显著差异(Brown, 2000; Brownetal., 2003)。在中国，烟粉虱MED隐种(即Q型烟粉虱)是目前分布最广并对作物造成危害最严重的烟粉虱隐种。自2003年该隐种在国内首次报道以来，它已逐年取代了其他烟粉虱隐种成为田间烟粉虱优势隐种(Chuetal., 2006, 2010; Tengetal., 2010)。

钙离子是真核生物细胞内重要的第二信使，其浓度变化是细胞生理功能调控过程中最关键的因素之一(Schneider, 1994)。钙离子结合蛋白(calcium-binding protein, CaBP)含有保守的EF-手型(EF-hand)结构域，并且当其与钙离子结合后能够改变三维构象，从而与下游靶标结合引发后续生理变化(Kretsinger and Nockolds, 1973; Sorensenetal., 2002)。作为一种细胞内广泛分布的调控蛋白，钙离子结合蛋白通过与钙离子可逆性的结合在钙离子信号通路中发挥着重要的作用(Mikhaylovaetal., 2011; Bagur and Hajnóczky, 2017)。由于钙离子结合蛋白参与细胞从增殖到凋亡的各个环节，因此在生物体的正常生长发育中是一类不可或缺的蛋白。前期研究发现，烟粉虱体内2个钙离子结合蛋白(BtCaBP1和BtCaBP2)参与稳定细胞内钙离子浓度，从而增强烟粉虱对双酰胺类杀虫剂溴氰虫酰胺的耐药能力(Guoetal., 2019)。然而，在上述研究中仅观察了基因干扰后48 h的自然死亡率，并未对烟粉虱后续的生物学参数进行持续观察。这2个钙离子结合蛋白基因表达受到抑制是否影响烟粉虱的生物学特性并不清楚。

为了系统揭示钙离子结合蛋白对烟粉虱生物学的影响，本研究利用dsRNA饲喂法干扰了烟粉虱2个钙离子结合蛋白基因(BtCaBP1和BtCaBP2)表达后，进一步比较了处理组与对照组烟粉虱亲代雌雄成虫寿命、单雌产卵量以及子一代卵孵化率和成虫前期发育历期的变化。研究结果进一步明确了BtCaBP1和BtCaBP2对烟粉虱生物学的影响。

1 材料与方法

1.1 试虫

本实验的烟粉虱MED隐种初始种群于2012年采自山东省济南市，在实验室以棉花(鲁棉研28号)进行继代饲养至今。烟粉虱饲养环境为：温度27±1℃，相对湿度60%±5%，光周期16L∶8D。

1.2 烟粉虱钙离子结合蛋白基因的RNA干扰

根据BtCaBP1(GenBank登录号: MK204650),BtCaBP2 (GenBank登录号: MK204651)和EGFP(GenBank登录号: JQ693016)的序列信息，分别设计dsRNA引物，并在引物5′端添加T7启动子序列,引物序列见表1。利用Trizol法提取烟粉虱总RNA，根据TaKaRa反转录试剂盒(PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit)合成cDNA，利用PCR分别扩增BtCaBP1,BtCaBP2和EGFP。PCR反应体系(50 μL): cDNA模板2 μL, Ex Taq酶0.25 μL(TaKaRa, 大连), 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL(引物序列见表1), 10×Ex Taq Buffer 5 μL，加水补足50 μL体系。PCR反应程序: 94℃ 3 min; 94℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 30 s, 5个循环; 94℃ 30 s, 70℃ 30 s, 72℃ 30 s, 35个循环。分别以3个基因的PCR扩增产物为模板，参照Thermo Scientific 体外双链RNA(dsRNA)合成试剂盒(TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit)进行dsRNA的合成。合成后利用酚仿抽提法回收双链RNA，并置于-20℃保存待用。

采用dsRNA饲喂法进行RNA干扰，随机收集300头的烟粉虱MED隐种1日龄成虫，置于50 mL饲喂装置中，其中饲喂管一侧装有dsRNA (500 ng/μL) 1.5 mL的蔗糖水溶液(25%)，另一侧覆盖有纱网。将装有试虫的饲喂管置于人工气候室中(温度: 27℃±1℃；相对湿度: 60%±5%)。对照组同样收集300头烟粉虱MED隐种1日龄成虫，饲喂含有等量dsEGFP的蔗糖水溶液。饲喂 dsRNA 3 d后，随机取出3组烟粉虱，每组30头。利用上述方法提取烟粉虱总RNA并合成cDNA，利用qPCR法检测RNA干扰效果。qPCR反应体系(20 μL): cDNA模板1 μL, 2×SYBR®Premix Ex TaqⅡ预混液10 μL(TaKaRa, 大连), 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL(引物序列见表1), 加水补足20 μL体系。阴性对照为不加任何模板的qPCR反应。所有样品3个生物学重复。qRT-PCR反应程序: 95℃ 30 s; 95℃ 10 s, 60℃ 30 s, 40个循环。循环结束后添加溶解曲线。根据前期研究结果(Lietal., 2013; Guoetal., 2017)，本实验选择琥珀酸脱氢酶复合物亚基A基因(SDHA)作为内参基因，并采用2-ΔΔCt分析目标基因的相对表达水平(Pfaffl, 2001)。

表1 本实验所用引物序列Table 1 Primers used in the study

1.3 钙离子结合蛋白基因干扰后烟粉虱MED隐种亲代寿命和产卵量观测

收集1.2节中饲喂dsRNA 3 d后的烟粉虱MED隐种成虫，分辨雌雄并按照雌∶雄=1∶1的比例放入预先准备好的水培棉花苗中，5～10对一组，3组重复。每天检查棉花苗中成虫的死亡情况以及死亡成虫的性别，每5 d更换一次叶片，并统计叶片上的卵数。直至所有成虫死亡。计算亲代成虫单雌产卵量，单雌产卵量={∑[每棉花苗上5 d总卵量/(总雌虫数+第1天总活雌虫数+第2天总活雌虫数+…+第5天总雌虫数)]}×5。

1.4 钙离子结合蛋白基因干扰后烟粉虱MED隐种子代生长发育指标测定

收集1.2节中饲喂dsRNA 3 d后的烟粉虱MED隐种成虫分辨雌雄并按照雌∶雄=1∶1的比例放入预先准备好的水培棉花苗中，15～20对一组，3组重复。在水培苗中产卵24 h后，清除所有成虫。每天记录水培棉花苗上卵的孵化情况，以及子一代成虫前期的生长发育情况。需统计的子一代生物学参数包括卵孵化率和成虫前期的发育历期。

1.5 数据分析

基因表达水平、亲代雌雄成虫寿命、单雌产卵量以及子一代卵孵化率和成虫前期发育历期采用平均值±标准差的形式表示。利用Graphpad 3.0软件，采用Student氏t检验方法进行差异显著性分析，P<0.05为差异显著。

2 结果

2.1 饲喂dsRNA后烟粉虱MED隐种成虫体内靶标基因的表达水平变化

饲喂dsRNA 3 d后，利用qPCR的方法检测不同处理组中靶标基因mRNA的表达水平。与饲喂dsEGFP的对照组相比，饲喂dsBtCaBP1的处理组烟粉虱MED隐种成虫BtCaBP1表达水平降低了36.30%(P<0.05)，而饲喂dsBtCaBP2 3 d后烟粉虱MED隐种成虫体内BtCaBP2表达水平降低了47.01%(P<0.05)(图1)。因此，饲喂dsBtCaBP和dsBtCaBP2 3 d均能够显著降低烟粉虱MED隐种成虫体内相应靶标基因的表达水平。

2.2 钙离子结合蛋白基因干扰后对烟粉虱MED隐种亲代成虫寿命的影响

与饲喂dsEGFP的对照组雌成虫寿命(13.25±0.58 d)相比，干扰BtCaBP1后雌成虫寿命(12.58±1.11 d)没有明显变化(P>0.05)，而干扰BtCaBP2后雌成虫寿命(15.46±1.24 d)显著延长(P<0.05)(图2: A)。相似的情况同样出现在雄虫中，饲喂dsBtCaBP2后雄成虫寿命延长至13.84±0.38 d，显著大于对照组的雄成虫寿命(12.67±0.65 d)(P<0.05)，而饲喂dsBtCaBP1的雄成虫寿 命(12.71±0.67 d)没有显著变化(P>0.05)(图2: B)。

图1 分别饲喂dsEGFP, dsBtCaBP1和dsBtCaBP2 3 d后烟粉虱MED隐种成虫体内BtCaBP基因的相对表达量Fig. 1 Relative expression levels of BtCaBP genes in Bemisia tabaci MED adults after feeding on dsEGFP,dsBtCaBP1 and dsBtCaBP2, respectively, for 3 d图中数据为3次实验重复的平均值±标准差；柱上星号表示与对照组(饲喂dsEGFP)相比经Student氏t检验方法比较在P<0.05水平差异显著。Data in the figure are mean±SD (n=3). The asterisk above bars indicates significant difference from the control (feeding on dsEGFP) by Student’s t-test (P<0.05). 下图同The same for the following figures.

图2 分别饲喂dsEGFP, dsBtCaBP1和dsBtCaBP2 3 d后烟粉虱MED隐种亲代雌(A)和雄(B)成虫寿命Fig. 2 Longevity of female (A) and male (B) adults of Bemisia tabaci MED after feeding on dsEGFP, dsBtCaBP1 and dsBtCaBP2, respectively, for 3 d

2.3 钙离子结合蛋白基因干扰后对烟粉虱MED隐种亲代产卵量的影响

与对照组的单雌产卵量(76.06±4.76)相比，干扰BtCaBP2后亲代单雌产卵量(39.53±3.04)显著下降(P<0.05)，而干扰BtCaBP1后亲代单雌产卵量(63.47±4.26)与对照组没有显著差异(P>0.05)(图3)。

图3 分别饲喂dsEGFP, dsBtCaBP1和dsBtCaBP2 3 d后烟粉虱MED隐种亲代成虫的单雌产卵量Fig. 3 Number of eggs laid per female adult of Bemisia tabaci MED feeding on dsEGFP,dsBtCaBP1 and dsBtCaBP2, respectively, for 3 d

2.4 钙离子结合蛋白基因干扰后对子一代烟粉虱MED隐种卵孵化率的影响

与对照组子一代卵孵化率(87.22%±3.21%)相比，干扰BtCaBP1后子一代卵孵化率(83.22%±7.55%)没有明显变化(P>0.05)，而干扰BtCaBP2后卵孵化率(81.58%±4.42%)显著降低(P<0.05)(图4)。

图4 亲代烟粉虱MED隐种成虫分别饲喂dsEGFP,dsBtCaBP1和dsBtCaBP2 3 d后子一代的卵孵化率Fig. 4 Egg hatching rate of offspring of Bemisia tabaci MED adults feeding on dsEGFP, dsBtCaBP1 and dsBtCaBP2, respectively, for 3 d

2.5 钙离子结合蛋白基因干扰后对子一代烟粉虱MED隐种成虫前期发育历期的影响

干扰BtCaBP1后子一代成虫前期发育历期(26.66±0.73 d)与对照组(27.52±1.73 d)之间没有显著差异(P>0.05)，而干扰BtCaBP2后子一代成虫前期发育历期(24.42±1.09 d)显著缩短(P<0.05)(图5)。

图5 亲代烟粉虱MED隐种成虫分别饲喂dsEGFP,dsBtCaBP1和dsBtCaBP2 3 d后子一代成虫前期发育历期Fig. 5 Pre-adult duration of offspring of Bemisia tabaci MED adults feeding on dsEGFP, dsBtCaBP1 and dsBtCaBP2, respectively, for 3 d

3 讨论

本研究通过dsRNA饲喂法干扰烟粉虱钙离子结合蛋白基因BtCaBP1和BtCaBP2后，发现烟粉虱2个钙离子结合蛋白基因干扰具有不同的生物学效应，其中BtCaBP2基因干扰后烟粉虱的单雌产卵量显著降低，并且子一代卵孵化率受到了明显的抑制；而BtCaBP1基因干扰后则没有显著生物学效应。已有研究表明钙离子结合蛋白及其参与的钙离子信号通路在无脊椎动物某些特定的发育过程中发挥着重要作用(Taft and Yoshino, 2011)。其中，钙调素作为一种保守性最高的钙离子结合蛋白在昆虫的生长发育过程中被广泛研究。研究表明，钙调素在果蝇Drosophila胚胎中线期的信号转导过程中发挥着重要作用，降低钙调素的调控水平会严重影响胚胎的正常发育(Hsouna and Vanberkum, 2008)。利用选择性的抑制剂干扰血吸虫Schistosomamansoni体内钙调素的功能后，能够干扰血吸虫卵的正常孵化，造成幼虫的非正常发育，最终导致死亡(Katsumataetal., 1989; Kawamotoetal., 1989)。近期有研究显示，通过饲喂干扰褐飞虱Nilaparvatalugens体内钙调素基因表达后，若虫无法正常蜕皮，雌成虫体内卵黄蛋白显著下降，雌成虫繁殖力显著下降，因此钙调蛋白可能作为害虫防控中的一个重要靶标(Wangetal., 2018)。结合本实验结果及上述研究表明，钙离子结合蛋白通过调控钙离子的信号转导在昆虫及其他无脊椎动物的发育和繁殖过程中发挥着关键作用。但是，分别干扰BtCaBP1 与BtCaBP2为何对烟粉虱发育产生的影响不同，BtCaBP2基因是如何对烟粉虱生殖力以及卵的发育产生影响，以及BtCaBP1基因是否能够从其他方面对烟粉虱产生影响尚需进一步证明。

干扰BtCaBP2对烟粉虱繁殖力和卵孵化率产生抑制作用，但是烟粉虱亲代成虫的寿命却显著增加，子一代成虫前期发育历期显著缩短。前人研究表明，钙离子结合蛋白通过参与刺吸式口器昆虫取食过程中对植物防御反应的影响，从而改变昆虫的生长发育状态。具体表现在刺吸式口器昆虫在取食时会释放出大量钙离子结合蛋白，该类蛋白能够消除钙离子诱导的植物体筛管内阻塞物的形成(Willetal., 2009)。例如，巢菜修尾蚜Megouraviciae在取食时会释放出钙离子结合蛋白，与豆科植物筛管中的钙离子结合，引起forisome蛋白的收缩，进一步阻止了筛管的阻塞并保证了蚜虫的持续取食(Willetal., 2007; Atamianetal., 2013)。稻叶蝉Nephotettixcincticeps取食时同样会向筛管中释放出一种抑制筛管堵塞的钙离子结合蛋白以保证其正常的取食行为(Hattorietal., 2012)。因此，如果干扰刺吸式口器昆虫在取食过程中释放到植物中的特定钙离子结合蛋白，会增强植物的防御反应，进一步阻碍刺吸式口器昆虫的正常取食，从而造成死亡率的显著增加(Yeetal., 2017)。我们推测，本研究中的BtCaBP2可能并不属于烟粉虱取食过程中分泌到植物中的一种钙离子结合蛋白，因此干扰BtCaBP2不会通过改变植物的防御反应的变化影响亲代烟粉虱的寿命。其次，BtCaBP2更可能在烟粉虱生殖方面发挥着关键作用。在多数昆虫生长发育中存在一种权衡关系(trade-off)，即繁殖力的增加是以生存能力的降低为代价的(Williams, 1966; Harshman and Zera, 2007)。由于BtCaBP2处理组烟粉虱繁殖力明显减弱，因此更多的能量可能用于虫体自身的生存能力，导致亲代成虫的寿命显著延长，子一代成虫前期的发育历期明显缩短。

综上所述，本研究表明，与BtCaBP1相比，BtCaBP2在烟粉虱的繁殖与生长发育中发挥着更加重要的作用，该结果为后续进一步研究钙离子结合蛋白的生物学功能提供了参考。