猴头菇菌丝体蛋白制备工艺研究

刘广建 郑惠华 蒋 益 桑 花 薛 璟 季宏更 张 蕾

（1江苏省苏微微生物研究有限公司，江苏无锡214063；2江苏安惠生物科技有限公司，江苏南通226009）

猴头菇是一种营养价值极高的食用药用真菌，含有丰富的多糖、多肽、萜类、甾醇类等活性成分，具有抗肿瘤，降血糖，降血脂等诸多功效。现代研究表明猴头菇活性蛋白具有免疫调节作用，活性肽则有抗氧化功效。猴头菇的多肽组合物可以改善老年痴呆小鼠的学习能力。Chen Diling等采用化学分离结合药效学评估方法，从猴头菇中分离单带蛋白（HEP3）。该蛋白通过调节肠道微生物群落的组成和代谢来改善免疫系统，激活T细胞的增殖和分化。辅助试验还表明，HEP3可作为肿瘤负荷小鼠的抗肿瘤免疫抑制剂。近些年来随着人们养生意识的提高，猴头菇也因此成了国内外极力追捧的明星级食药用菌。试验以猴头菇菌丝体为原料，对菌丝体蛋白的多种提取工艺进行优化，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法测定其分子量分布，为猴头菇菌丝体蛋白和多肽的进一步研究和开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

猴头菇菌丝体由液体发酵所得，经测定蛋白质含量35.2%；考马斯亮蓝G250、R250（分析纯）、牛血清蛋白（分析纯）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、N，N，N，N-四甲基乙二胺（TEMED）、木瓜蛋白酶（为国药集团化学试剂有限公司生产）；蛋白质marker（8～180 kD）、SephadexG-100（为常州天地人和生物科技有限公司生产）；其余试剂均为市售分析纯。

仪器设备：Alpha-1500型紫外可见分光光度计（上海谱元仪器有限公司生产）；JY98-111DN型超声波细胞粉碎机（宁波新艺超声设备有限公司生产）。

1.2 试验设计

1.2.1 碱提酸沉法提取猴头菇菌丝蛋白最佳工艺条件的确定

在单因素试验基础上，碱提酸沉法以pH、料液比、温度、时间为试验因素。采用4因素3水平L9（34）正交试验，确定最佳菌丝体蛋白提取工艺条件。因素水平见表1。

表1 碱提酸沉法提取菌丝蛋白质正交试验因素水平

1.2.2 酶法提取猴头菇菌丝体蛋白最佳工艺条件的确定

在单因素试验基础上，酶法提取以加酶量、料液比、温度、时间为试验因素。采用4因素3水平L9（34）正交试验，确定最佳提取工艺条件。因素水平见表2。

1.2.3 超声波提取猴头菇菌丝体蛋白最佳工艺条件的确定

采用超声波辅助浸提的方法，在超声功率、超声时间和超声温度单因素试验的基础上，采用Box-Benhnken方法设计三因素三水平试验，以蛋白提取率为响应值，进行响应面分析得到优化组合条件。试验数据采用Excel进行整理和绘图，Design-Expert 8.0统计分析软件进行多元二次回归模型方程的建立及方差分析，运用该软件中响应面值优化程序求得当响应面值最大时各因素的最佳组合。响应面试验因素水平见表3。

表2 酶法提取猴头菇菌丝体蛋白正交试验因素水平

表3 超声波提取菌丝体蛋白响应面分析试验因素水平

1.3 试验方法

1.3.1 牛血清蛋白标准曲线的绘制

考马斯亮蓝比色法。精确称取10 mg牛血清蛋白标准品，加入100 mL容量瓶中，用蒸馏水溶解后定容，得到0.1 mg/mL的牛血清蛋白标准液。分别取标准液0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL于10 mL具塞试管中，加蒸馏水至1 mL，再分别向试管中加入配制好的考马斯亮蓝G250溶液5 mL，摇匀，避光反应5～10 min后，在波长595 nm处测定其吸光度值，绘制牛血清蛋白标准曲线。

图1牛血清蛋白标准曲线

1.3.2 猴头菇菌丝体蛋白等电点确定

蛋白质碱提酸沉方法，取等量的碱提离心液调pH至不同值，离心所得上清液采用考马斯亮蓝比色法测定其吸光度值，吸光度值最低点的pH就为等电点pI值。

1.3.3 猴头菇菌丝体蛋白提取

将猴头菇菌丝体于65℃烘干粉碎后过100目筛，备用。称取猴头菇菌丝体粉，在一定条件下浸提，6000 r/min离心15 min，取上清液，用0.1 moL/L的盐酸调pH至等电点，静置1 h，8000 r/min离心15 min，得蛋白质沉淀，加一定量蒸馏水溶解蛋白质，然后用0.01 moL/L的NaOH溶液中和至pH7.0，冷冻干燥，得猴头菇菌丝体蛋白。

1.3.4 蛋白质的纯化及测定

SephadexG-100凝胶柱纯化菌丝体蛋白质；参照GB5497—1985，用凯氏定氮法测定蛋白质含量；SDS-PAGE测猴头菇菌丝体蛋白分子量。

2 结果与分析

2.1 等电点确定

由图2可知，猴头菇菌丝体蛋白的等电点pI值为3.05。

图2 等电点的确定

2.2 猴头菇菌丝体蛋白提取工艺条件确定

2.2.1 碱提酸沉法提取猴头菇菌丝体蛋白最佳条件的确定

正交试验结果见表4。由表4可知，极差分析，RA＞RD＞RC＞RB，可见影响菌丝体蛋白提取效果的因素依次为：A＞D＞C＞B，即料液比＞时间＞温度＞pH。方差分析结果表明，温度、pH、料液比、提取时间四因素中pH对提取率影响弱。提取蛋白质的最佳条件为 A3B3C2D1，即料液比 1∶25，pH10.5，提取 时 间1.5 h，温度25℃。经验证试验，该条件提取猴头菇菌丝体蛋白，提取率为22.75%，确为最优组合。

2.2.2 酶法提取猴头菇菌丝体蛋白最佳条件的确定

正交试验结果见表5。由极差分析可知，4个因素极差大小顺序为：RD＞RA＞RC＞RB，即影响酶法提取工艺的最主要因素是温度，料液比次之。方差分析结果表明，温度、料液比对提取率影响极显著，酶用量影响较小。最佳提取条件为A3B3C2D1，即料液比为1∶25，1%的木瓜蛋白酶酶液0.3 mL，温度为25℃，提取时间为1.5 h。经验证试验，该提取条件提取猴头菇菌丝体蛋白的提取率为21.04%，确为最优组合。

表4 碱提酸沉法提取猴头菇菌丝体蛋白正交试验结果

表5 酶法提取猴头菇菌丝体蛋白正交试验结果

2.2.3 超声波提取猴头菇菌丝体蛋白最佳工艺条件的确定

在单因素试验结果的基础上，根据Box-Benhnken设计原理，以超声功率、超声时间、超声温度3个因素为自变量，以猴头菇菌丝体蛋白提取率为响应值，采用响应面法进行三因素三水平的试验设计，共包括17组试验方案，试验设计方案及结果见表6。

表6 响应面试验设计及结果

模型建立与方差分析：利用设计软件Design-Expert对表6数据进行多元回归拟合，获得超声时间（A）、超声温度（B）、超声功率（C）的二次多项回归方程为：

Y=23.09-5.46A+2.75B+1.48C+0.15AB-0.14AC+0.24BC-3.31A2-1.52B2-1.14C2，此回归模型方程的ANOVA分析结果见表7。

表7 响应面试验回归模型方差分析

图3 各两因素交互作用对猴头菇蛋白提取影响的响应面图及等高线图

由表7结果可见：拟合方程具有较高的F值（F=12.55）和非常低的P值（P=0.0015），说明回归方程达到比较显著的水平（P=0.0015，R2=0.9417）；失拟项的P=0.1156＞0.05，试验数据与模型预测数据差异不显著，表明该拟合方程与实际拟合较好。试验结果相关系数模型的决定系数R2为0.9417，表明猴头菇菌丝体蛋白提取率的试验值与预测值由较好的一致性，调整决定系数R2Adj为0.8667，说明该模型能解释86.67%响应值的变化，有约总变异13.33%的不能由回归模型来解释。综上所述，该二次回归模型拟合程度好，试验误差较小，该模型方程可对猴头菇菌丝体蛋白提取条件进行预测和分析。

由F值可以看出，3个因素对猴头菇菌丝体蛋白质提取率影响程度依次为超声时间（A）＞超声温度（B）＞超声功率（C）；由响应面模型分析得出最佳的提取参数为提取时间21.8 min、温度34.6℃、微波功率758.6 W，提取率为27.3%。

响应面分析：根据回归模型，由Design-Expert 8.0.6软件绘制响应面分析图和等高线图（图3）。从响应面分析图中可以看出各因素交互作用对猴头菇菌丝体蛋白质提取率的影响：对提取率影响越大的因素，其曲线走势会相对越陡；在等高线图中，各因素对猴头菇菌丝体蛋白提取率的影响体现在其轴向等高线的密集程度上，轴向等高线越密集，说明该因素对猴头菇菌丝体蛋白提取率的影响越显著。通过比较图3中响应面分析图和等高线图可以看出：超声时间（A）与超声温度（B）两因素之间的交互作用对猴头菇菌丝体蛋白提取率的影响较为显著，而其他因素两两之间的交互作用对提取率的影响较小。

2.3 猴头菇菌丝体蛋白质含量及其分子量的测定

经凯氏定氮法测得猴头菇菌丝体中蛋白质含量为35.2%，提取所得猴头菇菌丝体粗蛋白中蛋白质含量为59.53%，通过SephadexG-100凝胶过柱纯化后，蛋白质含量为81.35%（过柱纯化后蛋白质得率太低仅为10%，主要为水溶性蛋白）。

样品蛋白质用10%浓度的分离胶，SDS-PAGE分析蛋白亚基分子质量，结果见图2。主要蛋白质分子量为：过柱纯化后样品蛋白质57 kD和35 kD（过柱用蒸馏水洗脱，主要为水溶性蛋白，蛋白浓度在0.2 mg/mL，条带色浅）；碱液复溶后的样品蛋白质主要有8个条带在90～24 kD（样品缓冲液加20%SDS才能跑出，蛋白浓度3 mg/mL，样品没纯化）。

图4 猴头菇菌丝体蛋白质SDS-PAGE分析

3 小结与讨论

猴头菇菌丝体蛋白的等电点为pH 3.05。生产中可以在等电点附近沉淀蛋白质，这样就不会因为pH过低而造成蛋白质变性，如本试验以pH4进行猴头菇菌丝体蛋白沉淀，菌丝体蛋白的得率与等电点沉淀蛋白的得率变化不大，而且猴头菇菌丝体蛋白保持较强的活性。

猴头菇菌丝体蛋白提取试验结果表明，碱提酸沉法提取蛋白质最佳条件为：料液比1∶25，pH 10.5，时间1.5 h，温度25℃，提取率为22.75%；酶法提取蛋白质最佳条件为：料液比为1∶25，1%木瓜蛋白酶酶液0.3 mL，温度为25℃，提取时间为1.5 h，提取率为21.04%。碱提酸沉法优于酶法提取。在碱提酸沉法和酶法提取的基础上，确定pH10.5、料液比为1∶25，超声波提取蛋白质，运用响应面研究分析得出最佳提取条件：提取时间21.8 min，温度34.6℃，微波功率758.6 W，提取率为27.3%。超声波提取法比碱提酸沉法，提取率提高了20%以上。

用凝胶柱纯化猴头菇菌丝蛋白，虽提高了蛋白质纯度，但也损失了大量的不溶性蛋白质（得率在10%左右），因此还要加强蛋白质溶解性方面以及蛋白质纯化方法的研究。

经SDS-PAGE分析猴头菇菌丝体蛋白亚基分子质量分析，猴头菇菌丝体蛋白分子量为24～90 kD。

试验表明，超声波提取方法提取猴头菇菌丝体蛋白操作简便，提取效果好，可用于工业化生产。