杏鲍菇液体摇瓶发酵培养基成分优化

张疏雨 冯 敏 李剑梅 柴林山 徐 冲 郭玲玲 关艳丽 马征远

（辽宁省微生物科学研究院，辽宁朝阳122000）

杏鲍菇（Pleurotus eryngii）[1-2]在传统栽培模式中的二级菌种往往采用固体枝条培养，这已经远不能满足杏鲍菇产业日益增长的需要。液体发酵技术生产菌丝体周期短、成本低、产量大，具有广阔的生产前景[3]。

不同的微生物对营养物质的要求不尽相同，一般微生物发酵培养基包括碳源、氮源、无机盐离子、微量元素和生长素等[4]。培养基中碳源、氮源等营养因子是微生物生长和代谢物合成所需营养物质的主要来源，它的种类、浓度等与细胞生长及其代谢物合成直接相关[5]。笔者前期研究了9种碳源（乳糖、甘油、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖、果糖、麸皮、淀粉）和10种氮源（酵母膏、尿素、玉米粉、牛肉膏、牛肉蛋白胨、牛肉浸膏、磷酸二氢铵、蛋白胨、胰蛋白胨、硫酸铵）对杏鲍菇发酵液菌丝干重的影响，筛选出葡萄糖、麸皮、蛋白胨、酵母膏为液体培养杏鲍菇较好碳氮源。试验以杂交育种选育得到的优良杏鲍菇1号菌株为模式菌株，以进一步提升试验菌株液体发酵能力、建立杏鲍菇高产菌株培养技术模型为目标，采用单因子及正交试验的方法，考察葡萄糖、麸皮、蛋白胨、酵母膏对发酵液菌丝体干重的影响，并获得初步结果，为建立杏鲍菇二级菌种培养技术模型提供科学数据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

试验菌株为杏鲍菇1号，由辽宁省微生物科学研究院提供。

1.2 培养材料及配方

培养原材料：葡萄糖、蛋白胨、硫酸镁、磷酸二氢钾、酵母膏、麸皮、玉米粉、蔗糖、麦芽糖、氢氧化钠、盐酸、琼脂等。

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，玉米粉2 g，磷酸二氢钾1 g，硫酸镁0.5 g，琼脂粉12 g，加水至1000 mL（pH7.0）。

摇瓶基础培养基：葡萄糖20 g，麸皮20 g，玉米粉 5 g，酵母膏 3 g，磷酸二氢钾1 g，硫酸镁 0.5 g，加水至1000 mL（pH7.0）。

1.3 仪器

HF Safe-1200生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司），LDZX-75KBS立式高压蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械有限公司），SPH-2102立式双层恒温摇床（上海世平实验设备有限公司），BCD-649WAD冰箱（青岛海尔股份有限公司），SPX-450生化培养箱[中仪国科（北京）科技有限公司）]。

1.4 试验方法

1.4.1 菌种活化

制备PDA平板培养基，在平板培养基中央接入杏鲍菇斜面菌种，在（25±1）℃条件下避光培养7 d，获得F1代试验菌株斜面培养物；无菌挑取新鲜斜面培养物于无菌水中，振荡处理成菌悬液，无菌涂布于预制好的PDA综合培养基上，18℃避光培养至平板上均匀布满菌丝为止，备用。

1.4.2 一级液体菌种的制备

制备摇瓶基础培养基，分装在250 mL三角瓶中，装入量为100 mL，121℃灭菌30 min。待培养基冷却后，无菌条件下，用经灭菌的直径6 mm打孔器打取已活化平板菌块，接种到摇瓶基础培养基中，每瓶4块。在摇床（140 r/min），恒温（25±1）℃，避光培养96 h，待瓶内产生细小均匀的菌球时终止培养，获得一级摇瓶菌种。

1.4.3 菌丝体摇瓶培养

将葡萄糖（g/L）、麸皮（g/L）分别按10，20，30，40，50，60，70，80；玉米粉（g/L）、酵母膏（g/L）分别按1，2，3，4，5，6，7，8，9加入摇瓶基础培养基中，250 mL三角瓶分装100 mL，灭菌冷却后每瓶接入10%一级摇瓶种，摇床（140 r/min）恒温（25±1）℃培养96 h。分别考察不同质量浓度的葡萄糖、麸皮、玉米粉、酵母膏对杏鲍菇发酵液菌丝体干重的影响，以确定碳、氮源优化质量浓度范围。每个处理重复3次。

1.4.4 菌丝生物量测定

将培养好的杏鲍菇发酵液用80目的筛网过滤，收集菌丝体，用水冲洗，于55℃烘干至恒重、称量。

1.4.5 杏鲍菇液体发酵培养基优化

设计4因素3水平L9（34）的正交试验，通过测定杏鲍菇发酵液菌丝体干重来确定影响杏鲍菇生长的最佳葡萄糖、麸皮、玉米粉、酵母膏的配比。正交试验因素水平见表1。

表1 正交试验因素与水平

图1 葡萄糖质量浓度对杏鲍菇发酵液菌丝干重的影响

2 结果与分析

2.1 适宜葡萄糖质量浓度

由图1可知，随着葡萄糖质量浓度的上升，杏鲍菇发酵液菌丝体干重呈先升高再降低的趋势。当葡萄糖质量浓度为30 g/L时，菌丝体干重最高，葡萄糖质量浓度超过50 g/L时，菌丝体干重下降加速。总体来看，葡萄糖质量浓度为30～40 g/L时，杏鲍菇发酵液的菌丝体干重最大。由此看出，碳源过量使发酵液的pH与黏度均发生改变，影响菌丝体的生长和代谢；碳源不足容易引起菌丝体的衰老和自溶。因此确定葡萄糖的适宜质量浓度为30～40 g/L。经计算，得菌丝体干重（y）与葡萄糖质量浓度（x）的函数关系式：y=1×10-5x3-0.002x2+0.0944x+1.3518，R2=0.9958，模型拟合较好。

2.2 适宜麸皮质量浓度

由图2可知，随着麸皮质量浓度的增加，杏鲍菇发酵液的菌丝体干重呈先升高再降低的趋势，麸皮适宜质量浓度为40～50 g/L。经计算，得菌丝体干重（y）与麸皮质量浓度（x）的函数关系式：y=2×10-7x4-4×10-5x3+0.0022x2-0.0325x+2.2205，R2=0.9936，模型拟合较好。

图2 麸皮质量浓度对杏鲍菇发酵液菌丝干重的影响

图3 玉米粉质量浓度对杏鲍菇发酵液菌丝干重的影响

2.3 适宜玉米粉质量浓度

如图3所示，玉米粉质量浓度从1 g/L增加到5 g/L时，随其质量浓度的增加，杏鲍菇发酵液的菌丝体干重呈明显上升趋势；当玉米粉质量浓度从5 g/L增加到6 g/L时，菌丝体干重下降，但下降幅度不大；当玉米粉质量浓度从6 g/L上升到8 g/L时，菌丝体干重下降明显。由此确定玉米粉的适宜质量浓度为4～6 g/L。经计算，得菌丝体干重（y）与玉米粉质量浓度（x）的函数关系式：y=0.0025x3-0.0485x2+0.2952x+1.9525，R2=0.9934模型拟合较好。

2.4 适宜酵母膏质量浓度

由图4可知，随着酵母膏质量浓度的增加，杏鲍菇发酵液菌丝体干重呈现快速升高后缓慢下降的趋势，在酵母膏质量浓度为4 g/L时菌丝体干重达到最高值。由此确定酵母膏的适宜质量浓度为3～5 g/L。经计算，得菌丝体干重（y）与酵母膏质量浓度（x）的 函 数 关 系 式 ：y=-0.001x4+0.0247x3-0.2131x2+0.7807x+1.5621，R2=0.9998模型拟合较好。

图4 酵母膏质量浓度对杏鲍菇发酵液菌丝干重的影响

2.5 杏鲍菇液体培养基优化

以葡萄糖、麸皮、玉米粉、酵母膏为试验因素，分别设3个水平，设计L9（34）正交表，进行杏鲍菇液体发酵培养基的优化试验，正交试验结果见表2、3。

表2 正交试验结果

从表2、表3可以看出，4个试验因素对杏鲍菇发酵菌丝体干重的影响程度依次为A（葡萄糖）＞B（麸皮）＞C（玉米粉）＞D（酵母膏），葡萄糖对菌丝体干重的影响最大，且存在显著性差异（P＜0.05），其次为麸皮。

表3 正交试验方差分析

试验最佳组合为A3B2C3D1，即最佳培养基配方为葡萄糖35 g，麸皮50 g，玉米粉6 g，酵母膏3 g，磷酸二氢钾1 g，硫酸镁 0.5 g，加水至1000 mL（pH7.0）。为了验证上述结果的可靠性，在最佳工艺条件下进行杏鲍菇液体发酵验证试验，重复3次，菌丝体干 重分别为 2.756 g/100 mL、2.737 g/100 mL、2.748 g/100 mL，平均为2.747 g/100 mL，3次结果差异较小，表明优化获得的工艺条件重复性好，稳定可靠。

3 小结

在单因素试验基础上进行多因素正交试验表明，对菌丝体（杏鲍菇1号）干重的影响程度依次为葡萄糖＞麸皮＞玉米粉＞酵母膏，葡萄糖对发酵液菌丝干重影响最大，且存在显著性差异（P＜0.05），其次为麸皮，获得了有利于杏鲍菇1号液体发酵的培养基基础配方。

相对于传统的枝条菌种来说，液体发酵具有周期短、产量大、操作简单等优势，随着对其研究的不断深入，工厂化大量生产发酵液菌丝体将成为可能，并将广泛应用于制作杏鲍菇二级菌种；同时发酵液菌丝体也可作为菌体蛋白应用在动物饲料或食品添加剂中。因此，液体发酵技术在杏鲍菇等食药用菌的生产中具有巨大的发展潜力。