通江银耳DNA提取方法的比较及优化

魏妮娜 吴 辉 王 莉 张青峰

（遵义医科大学珠海校区，广东珠海519041）

银耳（Tremella fuciformis）属真菌类银耳科（Dacryomycetaceae），又称白木耳、雪耳，有滋阴润肺、生津止咳、强精补肾、清热润肠、益胃补气等功效[1]。银耳在我国分布广泛，在西南地区主要分布在四川、贵州等省，四川通江是银耳的发源地，传承着段木栽培银耳方式；在沿海地区则主要是福建、广东及台湾等省，以福建古田银耳最为著名[2]。新鲜的通江银耳子实体与其他地区的银耳子实体有较大的差异，但烘干后差异较小，一般很难识别[3]。研究表明，分子生物学技术能够鉴别出在形态上并无差异的群体，而基因组DNA的质量是分子生物学鉴别的关键。

银耳子实体中含有大量的多糖、蛋白质以及胶质物，严重干扰了其基因组DNA的提取，很难进行后期的分子生物学方面的研究[4]。目前，商业化的真菌基因组试剂盒已经上市，但用于银耳的DNA微量提取时得率很低，无法进行PCR扩增[5]。已有研究表明，不同的提取方法适用的真菌差异较大[6-10]。研究拟采用4种方法提取新鲜银耳的总基因组，并对最佳方法进行优化，同时对3种不同储存方式的样品进行DNA提取和评价，探索出一种能够用新鲜银耳子实体提取出高质量DNA的方法，及选取合适的储存方式，以便进行后期的DNA指纹分析，作为传统鉴定方法的有效补充。

1 材料与方法

1.1 4种DNA提取方法的比较

将新鲜银耳（购于四川省通江县银耳有限责任公司）撕成小片，加入液氮研磨成粉末，采用传统CTAB 法[11]、CTAB 沉降法[12]、SDS-CTAB 法[13]、SDS法[14]提取银耳基因组总DNA，微量核酸检测其质量。

1.2 最佳方法的优化

采用CTAB沉降法将样品量扩大为约25 g左右，将CTAB的含量分别改变为3%、4%、5%，其余部分不变，NanoDrop One微量核酸蛋白浓度测定仪检测质量，0.8%的琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统观察并拍照。

1.3 提取不同储存方式保存的银耳DNA

分别将新鲜银耳进行以下处理：①风干储存，45℃烘干 24 h，-20℃保存 50 d（2019-01-17—2019-03-07）；②-20°C储存，-20°C保存50 d；③液氮储存，将液氮研磨后银耳-20°C保存50 d。采用最佳方法提取DNA，NanoDrop One微量核酸蛋白浓度测定仪检测质量，0.8%的琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统观察并拍照。

1.4 RAPD初步鉴定

选用数个随机引物对提取的银耳DNA进行扩增，PCR 扩增反应体系 25 μL，其中 Taq酶 0.5 μL，dNTP 0.5 μL，ddH2O 19.5 μL，10 × Buffer 2.5 μL，DNA 1 μL，RAPD引物 1 μL。RAPD扩增程序：95 ℃预变性5 min，重复35个循环，94°C变性45 s，35℃退火45 s，延伸72℃ 2 min，循环结束72℃延伸7 min，1.0%的琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统观察并拍照。

2 结果与分析

2.1 4种DNA提取方法提取银耳DNA检测结果

由表1可见，4种提取方法中，CTAB沉降法提取到的银耳DNA含量最高，达到了55 ng/μL，A260/A280在1.8～2.0表明其DNA纯度较高，传统CTAB法的DNA含量为36 ng/μL，A260/A280低于1.8，说明样品中有RNA污染。

表1 4种DNA提取方法提取银耳DNA检测结果

2.2 最佳提取DNA方法的优化

由表2可见，5%CTAB法提取到的银耳DNA含量最高，A260/A280为1.88，表示提取DNA较为纯净，3%CTAB的A260/A230为1.93，但含量明显低于5%CTAB法，4%CTAB法的A260/A280高于2.0，表明有蛋白质或其他杂质污染，提取效果差于5%CTAB法。

表2 最佳方法优化后DNA检测结果

将样品稀释至同一浓度（200 ng/μL）后电泳。由图1可见，每个样品有清晰完整的单一条带，但在250 bp的位置，每个样品都有一弥散的条带，说明在提取过程中均存在DNA的降解，其中3%CTAB法提取DNA降解最厉害。

图1 最佳方法的优化总DNA电泳图

2.3 不同储存方式保存的银耳DNA

由表3可知，液氮储存的样品核酸含量明显高于其他储存方式，A260/A280在1.8～2.0表明DNA较为纯净，而风干储存样品的A260/A280小于1.8，表明污染较为严重，-20°C储存的样品虽A260/A280较高，但核酸含量较低。

表3 不同储存方式的银耳DNA降解情况

由图2可见，2号泳道的样品无单一条带，整个泳道呈涂布状，DNA严重降解；3号泳道没有条带，DNA的含量较低；4号泳道有较为明亮的条带，但在250 bp处，有一个明亮的条带，部分DNA已发生降解。

图2 不同储存条件的总DNA电泳图

2.4 RAPD的初步鉴定

对40条引物进行筛选，引物（GGGAATTCGG）成功扩增出清晰条带4条：风干储存和液氮储存的样品分别成功扩增出4条清晰条带。-20°C储存的样品仅扩增出3条条带，缺少在100 bp附近的一条带。

图3 不同储存条件的PCR产物

3 小结与讨论

目前笔者只查询到一篇文献报道提取干品古田银耳的DNA，效果最好的是传统CTAB法。但笔者前期预试验中此法提取新鲜通江银耳DNA的质量差，故比较了常用的4种真菌DNA提取方法，提取效果最好的是CTAB沉降法。传统CTAB法不适宜提取通江银耳DNA，可能是由于通江银耳的多糖含量远高于古田银耳，或者由于银耳多糖的比例不等所致。试验表明CTAB沉降法的提取效果明显优于传统CTAB法，主要是沉淀DNA的试剂不同。沉淀DNA试剂有有机溶剂和低盐溶液。有机试剂有异丙醇和无水乙醇，异丙醇较无水乙醇疏水。传统CTAB法沉淀DNA，离心后底部有透明状体积较大的沉淀，用TE液溶解时间较长，溶液较为黏稠，流动性差，溶液中可能含有多糖或胶质。而CTAB沉降法沉淀DNA，因DNA在盐溶液中溶解度的差异，沉淀不黏稠，有效地避免了多糖的干扰。

鲜银耳含水量在80%～95%，不易长时间保鲜，常温保存2～4 d，4°C保存7 d。-20°C储存的样品DNA浓度低，降解严重，缓慢冻存过程中会出现大量的冰晶，冰晶促使DNA降解[15-20]，因而在RAPD结果中缺少一条带。风干储存的样品中DNA的完整性较差，降解较严重，可能是由于风干过程中温度升高，破坏了DNA的完整性，发生部分降解，但RAPD中成功扩增出4条带。液氮储存的样品的DNA纯度高，含量高，降解少，原因是液氮的快速冷冻，尽可能减少了冰晶的出现，直接冻成了玻璃体，DNA降解量最少。故在做后期分子生物学研究时，如需储存样品，可采用液氮或风干法。

研究对CTAB沉降法进行改良和优化，提取高糖含量通江银耳中DNA，无需芽孢分离或菌丝培养的中间步骤，建立一种直接用银耳子实体（新鲜或干品）提取高质量DNA方法。