代料栽培金耳出耳期易感染真菌病害多样性初探

田 霄 汪 威田云霞 童江云

（昆明市农业科学研究院，云南昆明650000）

金耳（Tremella aurantialba），也称脑型银耳、金银耳，隶属担子菌门（Basidiomycota）银耳科（Tremella）银耳属（Tremella），是一种珍贵的食药同源真菌。金耳子实体外观呈脑状，色泽金黄，富含胶质，食用口感爽滑；临床研究发现金耳多糖具有降低血糖、血脂，增强免疫力[1]，抗凝血[2]和抗肿瘤[3]等效果。金耳是食用菌中珍品，也是保健美容佳品，有着广阔的发展前景。

早在1982―1996年，刘正南等[4]成功引种驯化了野生金耳，并进行大面积推广，取得了良好的经济和社会效益。由于金耳自身特殊的生理特性和制种特性，金耳菌种尚不稳定。代料栽培金耳在原基形成初期容易遭到杂菌感染，导致烂耳和出耳不整齐，严重影响金耳产量和生物转化率[5]，阻碍了代料栽培金耳的大规模推广。研究金耳出耳期的病害发生原因，是降低金耳污染率，提高金耳产量和经济效益的重要环节。

真菌的ITS基因相比18SrRNA基因（其进化速率为18SrDNA的10倍）或28SrRNA基因而言整体的变异性更强，因而物种间的序列差异会更大，分类信息会更加详尽，具有高通量、高精度、极佳重现性和测序成本低等特点，被广泛应用于微生物生态学研究[6]。ITS包含ITS1和ITS2两个区域。ITS1位于真核生物18S和5.8S基因之间，ITS2位于真核生物5.8S和28S基因之间，其序列更长且包含信息更多。笔者选取代料栽培金耳出耳期受感染部位，进行ITS2高通量测序和菌种分离，分析其主要的真菌群落，为代料栽培金耳出耳期杂菌防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

（1）供试菌种：从云南省农业科学研究院引进金耳与毛韧革菌混合菌种。将混合菌种扩繁，待出耳且耳块长至5 cm左右后置于-4℃冰箱保存。（2）供试配方：栽培料配方为粗木屑79%，麸皮15%，硫酸钙1%，碳酸钙1%。（3）主要试剂和仪器。PCR采用KOD-401B：TOYOBO KOD-Plus-Neo DNA Polymerase；PCR 仪 ：Applied Biosystems®Gene Amp®PCR System 9700。

1.2 试验方法

1.2.1 代料培养

按配方制备栽培袋（121℃高压灭菌3 h）。将保藏的菌种从冰箱取出置于室温下，在无菌条件下，在栽培袋侧面部位打孔（直径约2 cm，深度约2 cm），挑取子实体1～2 cm和子实体下方少许混合菌丝接入栽培袋孔内，用透气密封条密封口，放置温度20～23℃，黑暗环境中培养30 d左右，至袋内长满白色粗壮的菌丝。此后10 d左右，接种块附近出现黄色分泌物，逐渐形成脑状原基。

1.2.2 取材

在原基形成后10 d内，选取受到杂菌感染的菌包，分别挑取三个样本：被感染的接种部位的培养料、菌包中间和底部的培养料，编号为TA-ZJ、TA1和TA2（图1）。每个样本5重复。

图1 金耳正常出耳、污染状态及采样处

1.2.3 样本DNA的提取与纯化

利用DNA提取试剂盒（Zymo Research BIOMICS DNA Microprep Kit D4301）对3个样本进行基因组DNA抽提。0.8%琼脂糖凝胶电泳对所提DNA进行检测。

1.2.4 ITS片段高通量测序鉴定

1.2.4.1 PCR扩增

利 用 特 异 引 物（ITS3_KYO2：5’-GATGAAGAACGYAGYRAA-3’和 ITS4：5’-TCCTCC GCTTATTGATATGC-3’）对样本DNA的ITS2区域进行扩增[7]：每个样本进行3次PCR重复。

1.2.4.2 PCR产物检测、纯化和定量

利用2%琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测。切胶回收（QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN）。

1.2.4.3 文库构建

文库构建用Illumina公司TruSeq DNA PCRFree Sample Prep Kit（FC-121-3001/3003）。

1.2.4.4 测序和生物信息分析及统计

用FLASH拼接双端序列。基于Barcode从reads中拆分出各样本序列。截去Barcode序列得到原始数据，然后用Trimmomatic进行质控。得到有效数据Clean Reads。

使用UCLUST分类法与UNITE数据库（https：//unite.ut.ee/）进行注释分析。用MAFFT version 7的FFT-NS-2算法将代表性序列进行多重比对。对各样本做均一化处理，以样本中数据量最少的为标准进行重抽样。

采用R语言进行各种数据转换，ggplot2构建热图。

1.2.5 真菌形态学鉴定

1.2.5.1 感染真菌的分离与纯化

采集的3个样本无菌条件下放置在PDF平板上，25℃培养至菌落形成。挑取平板上不同菌落的边缘部位进行多次纯化分离。

1.2.5.2 真菌的形态学鉴定

将纯化的菌株接种到PDA平板上，采用插片培养法，在接种平板边缘以45°斜插入3片盖玻片，25℃培养至菌丝长满平板。取出盖玻片制作成临时片，在电子显微镜下做镜检并拍照。参照文献将各真菌进行形态学鉴定[8-10]。

2 结果与分析

2.1 真菌群落组成分析

根据测序结果分析，3个样本相对丰度水平最高的菌群均为子囊菌门（Ascomycota）木霉属（Trichoderma）；同时在3个样本中相对丰度水平较高的菌群有担子菌门（Basidiomycota）考克娃酵母属（Kockovaella）、子囊菌门（Ascomycota）镰刀霉属（Fusarium）、青霉属（Penicillium）、曲霉属（Aspergillus）、拟青霉 属（Simplicillium）和 头 束 霉 属（Cephalotrichum）（图2）。

3个样本中，在TA1和TA2中发现的被孢霉门（Mortierellomycota）被孢霉属（Mortierella）群落相对丰度水平比样本TA-ZJ高，而担子菌门（Basidiomycota）柄环菌属（Podoscypha）、壶菌门（Chytridiomycota）小壶菌属（Spizellomyces）在TA-ZJ样本中未能鉴定到。

木霉属在整个序列相对丰度水平中，样本TA1达35%，TA2达19%，TA-ZJ高达63%。毛韧革菌所在的韧革菌属（Stereum）占据了较高的比例，相对丰度值分别为29%、38%和10%。金耳所在的银耳属（Tremella）占比较低，3个样本平均不到5%。

图2 各样本的感染真菌群落（属）

图3 感染真菌纯化菌株及其显微结构

2.2 形态学鉴定

经多次分离纯化后总共获得了100个菌株，形态学分析主要属于木霉属（分离菌株数75个）、镰刀霉属（分离菌株数7个）和青霉属（分离菌株数8个）其他菌株10个（图3A、B、C），经显微结构鉴定进一步证明其确实属于木霉属（图3A）、镰刀霉属（图3E）和青霉属（图3F）真菌。

3 小结与讨论

食用菌病害根据病害发生的原因分为三种类型：侵染性病害、竞争性病害和生理性病害。侵染性病害主要是病原菌侵染食用菌本身，导致菌丝死亡或者子实体出现斑点、畸形甚至腐烂；竞争性病害则是病原菌侵染栽培基质，与菌丝体争夺养分和生存空间导致食用菌凋亡[11]。金耳子实体是由金耳和毛韧革菌组成的异质复合体[12]，两者的关系目前还不够清晰[13]，关于金耳的主要病害研究目前鲜有报道。金耳出耳期发生病害的原因：接种栽培场地和栽培料因素，环境因素、水源因素，料袋灭菌因素，袋的质量因素，出耳期的湿度和通风管理因素等。金耳生长前期以毛韧革菌菌丝生长为主，到一定程度后金耳菌丝才开始生长[14]，两者比例失调会导致出耳率下降[15]，金耳幼耳本身抗病性差，且对不良环境敏感[1]，在开袋后容易受到来自外界空气和水中广泛存在的木霉、青霉等真菌病原菌的侵染而发生病害。

ITS2高通量测序结果表明，取样点主要感染菌群落属于子囊菌门木霉属，按丰度水平依次为孢霉属、镰刀霉属、考克娃酵母属、曲霉属、青霉属、拟青霉属和头束霉属。金耳出耳初期容易分泌黄水[5]，开袋后与外界空气接触，容易受到杂菌侵染。试验出菇房曾多年栽培香菇和平菇等菇类，杂菌孢子基数高，而金耳出耳期需要较高的空气相对湿度，若通风控制不当，易造成木霉感染。试验取样的菌袋前期菌丝生长正常，开袋出耳后出现感染，因此病原菌来自袋外可能性较高。形态学分析仅鉴定到三种真菌：木霉属、镰刀霉属和青霉属，其中分离木霉属菌株数最高，这一结果与高通量测序结果一致。另外从高通量测序结果可以看出，除了木霉属，其余杂菌属相对丰度水平都很低。肉眼观测取样的菌袋大部分为绿色木霉污染（图1），因受试验方法限制，仅能分离和提纯得到少量的属种。

自然界中各种微生物的种类和数量非常多，而木霉是感染食用菌培养料和子实体最严重的一种杂菌，笔者试验得出同样结果。为此，笔者对金耳出耳期的管理提出几点建议：首先，控制病原菌。木霉孢子及菌丝体广泛分布在自然界中，木霉等多数杂菌生长适温为22～28℃，与金耳菌丝生长适温相近，木霉菌丝很容易在金耳菌丝生长期大量繁殖，出耳期爆发。预防原则：一是源头把控，降低环境中杂菌基数、用水洁净，培养料灭菌彻底；其次，优化管理。木霉、青霉等杂菌喜欢高湿环境，其菌丝较耐二氧化碳，而金耳子实体的展开和转色也需要一定的氧气量，因此要协调好金耳出耳期的湿度与通气，保持空气相对湿度在85%～95%，随时监测出菇房内二氧化碳浓度，做到每天定时通风换气；第三，选择优良的金耳菌种及适宜代料配方，培养出高质量金耳出菇菌袋[11，16]。