动物源性食品中10种氨基糖苷类药物残留量的测定

郭亚娟　付晓燕　王武强　白娜　陈江

摘 要：本文建立了一套超高效液相色谱-串联质谱法检测动物源性食品中10种氨基糖苷类药物残留的方法。通过比较不同提取试剂和提取方式下目标物的回收率，优化前处理方式。采用Agela Technologies HILIC色谱柱（2.1×100 mm，3 μm），以0.1%甲酸甲酸铵溶液和0.1%甲酸乙腈为流动相，在ESI+模式下采用选择离子监测方式（SRM），基质标准外标法定量。结果表明，在50～4 000 mg·L-1范围内10种氨基糖苷类药物线性良好（R2>0.999 0），3种不同浓度的加标在动物肌肉、内脏中的回收率为71.5%～102%，RSD为3.8%～13.2%，在动物副产物中的回收率为65.5%～100%，RSD为2.0%～14.2%。该方法准确可靠，通用性强，可用于多种动物源性食品中10种氨基糖苷类药物残留的检测。

关键词：动物原性食品;氨基糖苷类药物;高效液相色谱-串联质谱

Abstract：A method was developed for the determination of aminoglycosides residues in foods of animal-derived foods by Ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. By comparing the recovery of the target substance under different extraction reagents and methods， the pretreatment method was optimized. Used the Agela Technologies HILIC column （2.1×100 mm， 3 μm）， 0.1% ammonium formate solution and 0.1% acetonitrile solution were used as mobile phase， and selected ion monitoring （SIM） was used in ESI+ mode. The results showed that the linearity of ten aminoglycosides was good in the range of 50～4 000 mg·L-1 （R2>0.999 0）. The recoveries of three different concentrations of aminoglycosides in animal muscle and viscera were 71.5%～102%， the RSD ranged 3.8%～13.2%， the recovery of animal by-products ranged 65.5%～100% ， and the RSD ranged 2.0%～14.2%. The method is accurate， reliable and versatile， and can be used for the determination of 10 aminoglycosides residues in various animal-derived foods.

Key words：Animal food; Aminoglycosides; High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

中圖分类号：R155.5

氨基糖苷类药物是一种广谱类抗生素，主要用于治疗细菌感染，尤其是革兰氏阴性菌引起的感染。由于该类抗生素结构稳定、不易降解，在动物组织中容易残留，给人类带来巨大的危害[1-2]。所以，建立一套完善、覆盖面广又便于使用的检测方法具有重要的现实意义。

目前报道的氨基糖苷类药物检测方法有HPLC-UV[3-4]、LC-MS[5-6]和HPLC-ELSD法[7]检测。但大多采用了离子对试剂且基质单一[7-9]。本文采用2%乙腈溶液作为提取溶液，用特定浓度的甲酸铵溶液代替七氟丁酸，在提供了电离所需的离子外，增强了目标物的保留，达到有效分离和检测的目的。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂

（1）仪器。AB SCIEX QTRAP 4500液相色谱串联质谱仪、Mettler Toledo电子天平、VORTEX-6旋涡混合器、AS30600BT超声水浴摇床、3K15高速冷冻离心机、TTL-DCⅡ氮吹浓缩仪。

（2）试剂。乙腈、甲酸为HPLC级，其他试剂均为分析纯。

（3）标准品。10种氨基糖苷类药物标准品：庆大霉素（GEN）、链霉素（STR）、双氢链霉素（DISTR）、卡那霉素（KAN）、潮霉素B（HYG）、壮观霉素（SPE）、安普霉素（AMI）、妥布霉素（TOB）、新霉素（NEO）、巴龙霉素（PAR），所有标品均来自德国Dr.ehrenstorfer公司。

（4）标准储备液。分别准确称取10种氨基糖苷类药物标准品各10 mg（根据标品纯度折算）于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配制成1 mg·mL-1的标准储备液，-18℃待用。

（5）标准工作液。选取猪肉、鸡肝、鱼肉、鸡蛋、牛奶、蜂蜜等具有代表性的空白基质配制标准 工作液，其中SPE、DISTR、STR、KAN、TOB、GEN、PAR的工作液浓度为50、100、200、500 ng·mL-1和1 000 ng·mL-1;

HYG、APR、NEO的工作液浓度为200、500、1 000、2 000 ng·mL-1和4 000 ng·mL-1。

（6）磷酸缓冲溶液。准确称取磷酸二氢钾1.36 g，用980 mL水溶解，用1.0 mol·L-1盐酸调pH到4.0，分别加入Na2EDTA 0.15 g和三氯乙酸20 g，溶解混匀并定容至1 000 mL（4℃避光保存）。

1.2 实验条件

1.2.1 色谱条件

Agela Technologies HILIC色谱柱（2.1 mm×100 mm，3 μm）;流速：0.3 mL·min-1;进样量：2 μL;柱温：35 ℃;流动相A：0.1%甲酸甲酸铵溶液（含30 mmol·mL-1甲酸铵），流动相B：1%的甲酸乙腈溶液（含1 mmol·mL-1甲酸铵）;梯度洗脱程序：0～1 min，10%流动相A+90%流动相B;1～5 min，流动相A 10%～97%;5～7 min，97%流动相A保持2 min;7.1～8 min，流动相A 97%～10%;8.1～12 min，10%流动相A保持。

1.2.2 质谱条件

电喷雾电离离子源（ESI）;SRM模式：正离子扫描;喷雾电压：5.5 kV;毛细管温度：550 ℃;雾化气压力（GS1）：50 psi;辅助气压力（GS2）：50 psi;气帘气压力（CUR）：25 psi;碰撞气压力（CAD）：8 psi。

1.3 样品前处理

（1）动物肌肉、动物内脏。准确称取2 g（精确至0.01 g）于50 mL聚丙烯离心管中，加入10 mL 2%甲酸乙腈提取液（pH为3±0.1），超声提取20 min，离心取上清液，重复提取2次，合并上清液。准确吸取10 mL过WCX净化样品，用3 mL 5%的氨水溶液、3 mL 100%甲醇依次淋洗，3 mL 5%甲酸甲醇，收集洗脱液，40 ℃氮吹至尽干，1 mL流动相A定容，过0.22 μm微孔滤膜，供液相色谱-串联质谱检测。

（2）水产品、牛奶、鸡蛋。准确称取5 g（精确至0.01 g）于50 mL聚丙烯离心管中，加亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液各1 mL，沉淀蛋白，提取方式同动物肌肉。

2 结果与分析

2.1 提取液的选择

氨基糖苷类抗生素结构中含有多个氨基和羟基，故呈碱性，极性和水溶性较高，所以在选取提取液时，分别比较了磷酸缓冲液、0.1%甲酸乙腈、2%甲酸乙腈（pH为3.0±0.1）等酸化提取液。结果如图1所示，0.1%甲酸乙腈的提取效果最差，磷酸缓冲液和2%甲酸乙腈提取液（pH为3.0±0.1）效果相当，但是基于乙腈有沉淀蛋白的效果，最终选择使用2%甲酸乙腈（pH为3.0±0.1）作为提取溶液。

2.2 净化方式的优化

分别比较了Waters Oasis HLB（60 mg，3 mL）、Waters Oasis WCX（60 mg，3 mL）、Waters Oasis MCX

（60 mg，3 mL）3种不同类型净化小柱的回收率，结果如图2所示。结果表明，氨基糖苷类化合物在HLB上基本无保留，在MCX上很难洗脱下来，而在WCX有很好的保留，同时也能达到较好的净化效果。之后我们又根据回收率优化了洗脱液和淋洗液，最终选择5%氨水溶液作为淋洗液，5%甲酸甲醇溶液作为洗脱液。

2.3 色谱条件的优化

本文考察了C18和HILIC两种不同色谱柱对10种氨基糖苷类药物残留的分离效果。结果表明，氨基糖胺类化合物在C18色谱柱上不易保留，出峰时间太早，容易引起基质干扰;而在HILIC色谱柱上得到了较好的保留，出峰时间明显推后，且峰型尖锐，见图3。故选用HILIC色谱柱。

分别比较了水-乙腈、甲酸水-乙腈以及甲酸甲酸铵-乙腈不同流动相对氨基糖苷类药物响应及峰型的影响，发现在流动相中加入甲酸后，目标化合物的电离效果明显提高，而加入甲酸铵缓冲液后，有利于稳定电离所需的酸性环境，所以最终确定选用以0.1%甲酸甲酸铵溶液和0.1%甲酸乙腈溶液为流动相。

2.4 质谱条件的优化

通过优化每个化合物的锥孔电压、碰撞电压等质谱参数，选择响应最高的离子作为定量离子，次之作为定性离子，见表1。

2.5 方法的线性范围、检出限、回收率以及精密度

由于此类化合物基质抑制效果明显，本方法采用基质配标，外标法定量的方法，对10种氨基糖苷类药物进行测定，以待测物的浓度作为横坐标，待测物的峰面积作为纵坐标，绘制标准曲线。结果显示，壮观霉素、双氢链霉素、链霉素、巴龙霉素、卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素在50～1 000 mg·L-1范围内线性关系良好，新霉素、潮霉素B、安普霉素在200～

4 000 mg·L-1范围内呈良好线性，选择基质抑制最强的空白基质，添加不同浓度的质量浓度，以其3倍信噪比

（S/N）确定其中壮观霉素、双氢链霉素、链霉素、巴龙霉素、卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素的检出限LOD为20 μg·kg-1;新霉素、潮霉素B、安普霉素的检出限LOD为100 μg·kg-1，见表2。

选取空白基质样品，通过添加低、中、高3种不同浓度质量浓度（LOQs、2×LOQs、3×LOQs），按优化的实验条件进行检测，每个添加水平做6个平行。结果表明，10种氨基糖苷类药物的回收率在65.5%～102%，相对标准偏差（RSD）在2.0%～14.2%。满足检测要求。

3 结论

本文采用2%甲酸乙腈作为提取溶剂，用WCX净化柱进行净化处理，通过优化流动相中甲酸、甲酸铵以及乙腈的配比，成功建立了一套不使用七氟丁酸离子对试剂，也能高效检测氨基糖苷类药物残留的方法。本文同时考察了鸡蛋、牛奶、蜂蜜、动物肌肉、内脏等可能检出氨基糖苷类药物残留的所有动物源性食品，基质覆盖面广，是一套准确、高效、通用性强的检测方法。

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