酪蛋白磷酸肽在婴幼儿配方奶粉中的功能及其检测方法研究

张永利　陶妃妃　杨雪　薛鑫　张小玲　罗自生

摘 要：酪蛋白磷酸肽（CPPs）作为酪蛋白的酶解产物，不仅能够为婴幼儿提供大量的必需氨基酸，还可以促进婴幼儿对矿质元素的吸收，具有预防龋齿、增强免疫力等作用。但自2012版GB 14880中规定酪蛋白磷酸肽可用于婴幼儿配方食品以来，关于婴幼儿配方奶粉中CPPs的检测方法一直处于空缺状态，直到2018年才发布了食品中CPPs检测的征求意见稿，但关于婴幼儿配方奶粉中CPPs的最佳检测方法也一直存在争议。本文中首先介绍了CPPs在婴幼儿配方奶粉中的作用，并针对婴幼儿配方奶粉中CPPs的检测方法进行了研究。

关键词：酪蛋白磷酸肽;婴幼儿配方奶粉;检测方法

Abstract：As an enzymatic hydrolysis product of casein， casein phosphopeptide can not only provide infants with a large amount of essential amino acids， but also promote the absorption of mineral elements by infants and young children， prevent dental caries and enhance immunity. But since 2012 edition Since GB 14880 stipulates that CPPs can be used in infant formula， the detection method for CPPs in infant formula has been in a vacant state. The consultation draft for the detection of CPPs in food was not released until 2018， but regarding infants and young children the best method for detecting CPPs in formula milk has also been controversial. This article first introduces the role of CPPs in infant formula， and studies the detection methods of CPPs in infant formula.

Key words：Casein phosphopeptide; Infant formula; Detection method

中图分类号：TS252.51

酪蛋白作为牛奶中的主要蛋白，能够给婴幼儿提供大量的必需氨基酸，但与乳清蛋白相比，酪蛋白更大且更硬，婴幼儿难以消化，若婴幼儿配方奶粉中酪蛋白比例过高，则可能导致婴幼儿食欲下降和消化不良等。近年来，许多研究表明酪蛋白的酶解产物能够与多种矿物质结合，促进其消化和吸收，酪蛋白磷酸肽（Casein phosphopeptides，CPPs）即是酪蛋白酶解产物的一种。国外对于CPPs的研究和应用较早，而我国直到2012年才在GB 14880-2012中将CPPs列为营养强化剂，并规定其在婴幼儿配方食品中的使用限量为≤3.0 g·kg-1，自此，贝因美、雅士利、飞鹤等婴幼儿奶粉品牌纷纷推出添加CPPs的产品，并受到了市场的广泛欢迎。2014年公布的GB 31617-2014《食品安全国家标准 食品营养强化剂 酪蛋白磷酸肽》中有规定CPPs原料的检测方法，但对于婴幼儿配方奶粉中CPPs的检测方法一直处于空缺状态。本文主要介绍了CPPs在婴幼儿配方奶粉中的作用，并探讨了婴幼儿配方奶粉中CPPs的检测方法。

1 CCPs在婴幼儿配方奶粉中的功能

1.1 促进钙的吸收，预防佝偻病

矿质元素一般是在肠道内被吸收利用，而在被吸收前必须是离子形式。以钙为例，在小肠前段部分，维生素D能够促进钙的主动吸收，但在小肠后段部分，钙只能靠被动吸收，其吸收效率与钙离子的浓度直接有关，且在中性或偏碱性环境中生成沉淀而流失，而CPPs可与钙直接结合，防止沉淀的生成，直至被肠壁吸收后才与钙分离。早在20世纪40年代，国外学者就从酪蛋白的酶解产物中分离得到磷酸肽，且证明这些肽类能够与钙盐结合形成具有较好溶解度的物质，从而增加钙的吸收利用率[1]。

目前，国内外婴幼儿配方奶粉中钙的强化来源仍然是以碳酸钙、磷酸三钙、磷酸氢钙等不溶性钙为主，其吸收利用率极低，这也是导致婴幼儿佝偻病的主要因素之一。关于婴幼儿佝偻病的预防，目前以补充维生素D为主，而添加CPPs能够在维生素D缺乏的情况下，强化婴幼儿骨骼的钙化，达到预防佝偻病的目的。此外其他的研究还表明，CCPs有助于螯合锌、铜、铁、锰、硒等矿物质元素的吸收[2]。

1.2 预防龋齿

据相关流行病学调查结果显示，我国儿童龋齿平均发病率高达71%（50%～90%），龋齿已经被世界卫生组织（WHO）列为继心血管疾病和肿瘤之后的第三大需要重点防治的疾病。据相关研究显示，CPPs能够与磷酸钙结合生成复合体CPP-ACP，而CPP-ACP具有促进牙釉质损伤修复和腐蚀牙齿再矿物质化[3]。目前在日用品行业，CPPs也被作为抗龋齿添加剂广泛应用于各大品牌牙膏中。喝奶粉的婴幼儿常会发生龋齿，即奶瓶性龋齿，是婴幼儿时期最常见的口腔性疾病之一，一旦发生龋齿则无法自愈。婴幼儿无法与成人一样用添加CPPs的牙膏进行牙齿清洁，因此通过在配方奶粉中添加CPPs能够有效预防婴幼儿龋齿的发生。

1.3 增强免疫力

在CPPs的結构中，共有3个氨基酸残基具有调节免疫的功能，其中有2个是磷酸丝氨酸残基，分别位于CPPs的N、C两端，形成Ser（P）-X-Ser（P）的结构。有研究表明，Ca2+是触发淋巴细胞增殖的第一信号，其对应的载体能够促进淋巴细胞的增殖。而CPPs中的Ser（P）结构能与Ca2+螯合，预防钙离子的沉淀，提高钙离子的吸收率，进而间接增强机体的免疫功能[4]。此外还有研究表明，CPPs能通过影响细胞因子的分泌来调节机体的免疫功能，国外学者发现CPPs能够促进小鼠脾细胞培养物中IL-5和IL-6的分泌，而IL-5能够促进B淋巴细胞的增殖，IL-6则能促进B淋巴细胞的分化，最终的结果是添加CPPs的小鼠脾细胞培养物中IgA水平明显高于对照组[5]。

2 酪蛋白磷酸肽的检测研究

自2012版GB 14880-2012中规定酪蛋白磷酸肽可用于婴幼儿配方食品以来，关于婴幼儿配方奶粉中CPPs的检测方法一直未发布国家标准检测方法，而GB 31617-2014附录A中的检测方法只适用于酪蛋白磷酸肽原料的检测，并不适用于食品中酪蛋白磷酸肽的检测。目前关于婴幼儿配方奶粉中CPPs的检测常用的主要有HPLC和HPLC-MS/MS法2种，下面分别进行介绍。

2.1 高效液相色谱法（HPLC）

随着色谱技术的飞速发展，HPLC已经在食品、日用品、药物等各大行业得到广泛应用。目前，国内大部分婴幼儿配方奶粉企业主要是采用液相色谱法检测CPPs，但由于缺乏国家标准方法的指导，不同企业具体检测方法及流程不尽相同，因此检测结果也会各有差异。2018年发布《食品安全标准 食品中酪蛋白磷酸肽的测定（征求意见稿）》中推荐的方法是

HPLC-MS/MS法，但许多学者对于婴幼儿配方奶粉中CPPs的最佳检测方法仍然存在争议。

HPLC法由于操作简单、检测准确、成本低廉等优点适用于全面推广应用，但其缺点在于特异性偏低，易受杂质峰的干扰，而奶粉成分复杂，不同配方及工艺可能产生不同的杂质峰，这就需要检测人员根据具体婴幼儿配方奶粉对HPLC流动相的梯度进行优化，避免杂质峰对特征峰的干扰。从目前研究来看，经过优化后HPLC法也能准确测量婴幼儿配方奶粉中的CPPs[6-8]。

2.2 液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）

婴幼儿配方奶粉成分十分复杂，且又分为干法工艺、干湿复合工艺、湿法工艺3种，因此不同成分及工艺的配方奶粉可能存在不同的干扰因素。HPLC-MS/MS结合了色谱和质谱的优势，具有极高的灵敏度和特异性，可以有效避免各种干扰因素[9]。但CPPs是酪蛋白的酶解产物，而酪蛋白又分为as1、as2、b等组分，因此不同厂家原料、生产工艺的差别，所生产的CPPs分子量也各不相同[10]。而在进行质谱分析时，必需先知道其分子量，筛选其特征肽段，才能确定最终的检测方法和换算系数，这在一定程度上增加了检测的难度。从征求意见稿中可知，HPLC-MS/MS检测婴幼儿配方奶粉中CPPs的定量限为0.1 g·kg-1，而目前市面上婴幼儿配方奶粉中CPPs的添加量一般在30～300 mg/100 g，因此该方法能够满足婴幼儿配方奶粉中CPPs的检测。

3 结语

目前市场上许多婴幼儿配方奶粉中都有强化CPPs。HPLC操作简单、成本低廉，但其特异性不高，易受杂质峰的干扰。HPLC-MS/MS具有较高的灵敏度和特异性，但因CPPs的分子量并不固定，需要根据具体原料筛选其特征肽段才能进行定量，因此操作难度要高于HPLC，此外HPLC-MS/MS检测成本也比HPLC高很多。因此，关于婴幼儿配方奶粉中CPPs的检测，HPLC和HPLC-MS/MS各有其优缺点。但综合考虑笔者认为HPLC法检测婴幼儿配方奶粉中CPPs的性价比更高。

参考文献：

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[3]田彦梅，张 园，叶 青，等.益生菌發酵羊乳中酪蛋白磷酸肽的持钙能力和结合铁能力的研究[J].食品与发酵科技，2019，55（4）：18-22.

[4]王龙江.试论生物活性肽在保健/功能食品中的应用[J].现代食品，2019（19）：105-106，109.

[5]王玉莹，陈锡威，冯凤琴，等.酪蛋白磷酸肽的研究进展[J].食品工业，2014，35（5）：204-208.

[6]胡 蓓，赖世云，张京顺，等.婴幼儿配方奶粉中酪蛋白磷酸肽2种检测方法的比较[J].食品安全质量检测学报，2018，9（19）：5212-5217.

[7]李 华，郑杭娣，陶妃妃.不同检测方法测定婴幼儿配方奶粉中CPPs含量的比较研究[J].现代食品，2019（12）：154-157.

[8]魏 敏，李兴佳，柴艳兵，等.高效液相色谱法检测婴幼儿配方乳粉中酪蛋白磷酸肽[J].乳业科学与技术，2019，42（5）：21-24.

[9]邵 琪，魏丽娜，张东丽，等.酪蛋白磷酸肽检测方法研究进展[J].食品研究与开发，2019，40（3）：220-224.

[10]胡 蓓，张京顺，柯 星，等.高效液相色谱-串联质谱法测定婴幼儿配方奶粉中酪蛋白磷酸肽含量[J].食品科学，2018，39（18）：286-291.