lncRNA NEAT1 对脂多糖所致肺泡巨噬细胞NF-κB 活化的影响＊

黄舒颖，张诚，黄自坤，罗清，卿城

（南昌大学第一附属医院，1.妇产科，2.超声科，3.检验科，4.重症医学科，南昌330006；5.江西卫生职业学院助产系，南昌330052）

脓毒症（sepsis）是由感染因素造成的宿主免疫反应失调，进而造成器官功能损害。 在脓毒症发展致使器官损害过程中， 肺部是最容易受到攻击并出现损伤的部位， 严重时常导致急性呼吸窘迫综合征 （Acute respiratory distress syndrome，ARDS）[1,2]。 尽管临床上采取抗生素使用、抗炎、保护性通气策略, 甚至体外膜肺氧合（ECMO，extracorporeal membrane oxygenation） 等综合措施来处理严重的ARDS，但不得不承认，该疾病的救治成功率仍然有限， 是当前重症医学领域面临的一道棘手的重点、难点问题[3]。

肺泡巨噬细胞（alveolar macrophage，AM）是肺部常驻免疫细胞，直接与外界空气相通，因此是呼吸系统抵抗致病微生物的第一道关卡[4,5]。疾病状态下，细菌等致病因素持续刺激AM 可导致炎症信号通路核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）活化，大量释放IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎症因子及各种趋化因子， 诱导中性粒细胞等炎症细胞在肺部聚集，炎症反应进一步级联放大，最终导致ARDS发生[6]。因此，AM 在ARDS 疾病发生及发展过程中扮演重要角色。

长链非编码RNA (Long non-coding RNA,lncRNA) 是一类长度大于200 个核苷酸的非编码RNA，在免疫、肿瘤等疾病中发挥了重要的调节作用。 近年有研究显示，lncRNA NEAT1 （以下简称NEAT1）与炎症免疫调节密切相关。 脓毒症时患者PBMC 细胞内NEAT1 表达显著上升， 是脓毒症诊断的一个分子标志物[7]；NEAT1 沉默可以改善脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）诱导的小鼠心肌损伤通过，其机制是通过抑制TLR2/NF-κB 信号通路实现的[8]。 我们在结核菌感染的RAW264.7 巨噬细中发现NEAT1 表达上调， 沉默NEAT1 可减弱其对胞内结核菌清除能力[9]。 但是在AM 中，NEAT1 的功能与作用尚未见报道。 因此，本研究以AM 为出发点，研究脓毒症条件下NEAT1 表达改变，以及NEAT1 沉默后对AM 炎症反应的调节机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 NR8383 大鼠肺泡巨噬细胞系购自中国科学院上海细胞研究所；LPS 购自美国sigma公司；DMSO 购自美国Hyclone 公司；PBS 缓冲液购自上海金穗生物科技有限公司； 胎牛血清购自上海依科赛；TRIzol 试剂和LipofectmineTM 2000转染试剂购自美国Invitrogen 公司；PCR 引物由中国上海生工生物工程公司合成；Ham’s F-12K 培养基、IL-6 ELISA 试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司； 逆转录试剂盒与荧光定量PCR 试剂盒购自大连宝生物TaKaRa 公司；siRNA 干扰试剂购自广州锐博公司。 兔抗NF-κB p65（ab16502）购买于美国Abcam 公司，山羊抗兔IgGg（ZB-5301）购买自中杉金桥。 Thermo Scientific NE-PER 购自赛默飞世尔中国； 荧光定量PCR 仪器采用美国ABI 公司Applied Biosystems 7600 系统。 其它所用试剂均为分析纯。

1.2 细胞培养 NR8383 大鼠肺泡巨噬细胞种植在含有FBS 的15%的Ham’s F-12K 完全培养基，培养基置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，2-3d 换液或传代一次。

1.3 siNEAT1 肺泡巨噬细胞转染 制备NEAT1 siRNA 以及control siRNA （siNC）， 具体由上海Gene Pharma 公司完成。siRNA 引物序列[11]：正义序列：5'-GUGAGAAGUU GCUUAGAAACUUUCC-3'，反义序列：5' - GGAAAGUUUCUAAGCAACUU CUCACUU-3'。 肺泡巨噬细胞分为三组：空白对照组，siNC 转染组以及siNEAT1 转染组。 细胞贴壁90 分钟后，根据LipofectamineTM2000 转染试剂说明书对siNC 或siNEAT1 进行转染操作，转染后细胞放在孵箱中培养4-6 h 后更换完全培养基，转染后24h 收集细胞，TRIzol 试剂提取细胞总RNA，RT-qPCR 检测siRNA 敲减效果。

1.4 细胞实验分组与处理 将对数生长时期的肺泡巨噬细胞加入24 孔板， 培养1 h， 随机进行分组：⑴对照组: 未经LPS 处理，加入等体积PBS; ⑵LPS 组: 加入终浓度10 mg /L 的LPS 培养12h；⑶siNC + LPS（10 mg /L）组；⑷siNEAT1 + LPS（10 mg/L） 组，12h 后分别收集各组分细胞和培养上清用于后续实验，每组实验重复3 次。

1.5 IL-6 蛋白测定 ELISA 试剂盒检测培养上清液IL-6 浓度，具体实验步骤参考试剂盒说明书。

1.6 IL-6 mRNA 和lncRNA NEAT1 测定 RTqPCR 检测各组细胞内IL-6 mRNA 和lncRNA NEAT1 表达，Trizol 法提取细胞总RNA, 按Takara逆转录试剂盒说明书将细胞中RNA 逆转录为cDNA;PCR 引物购买于上海生工生物公司。 以GAPDH 为内参基因,各基因引物序列如下:GAPDH上游引物:5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，下游 引 物 :5' -TGGTGAAGACGCCAGTGGA -3'。NEAT1 上游引物:5'-CTTCCTCCCTITAACTTATCC ATTCAC-3' ,下游引物:5' -CTCTTCCTCCACCATT ACCAACAATAC-3'[10]。 IL-6 上游引物: 5′-AAAC TAGTGAAATATATCCTGTTGTCAGG-3′，下游引物序列：5′-GGAAGCTTCCAACATTCATATTGTCAGT TC-3′[11]。qPCR 反应采用SYBR Premix EX TaqTM II，使用ABI 7500 系统进行上机，具体的检测步骤及反应条件设置都按照试剂盒说明书进行。 所有样品做3 复孔，RNA 相对表达量以2-△△Ct方法计算所得。

1.7 肺泡巨噬细胞NF-κB 核移检测 根据Thermo Scientific NE-PER 核蛋白-胞浆蛋白抽提试剂盒使用说明操作，提取细胞核蛋白。Western blot 实验检测细胞核内NF-κB p65 表达， 选取Lamin B 作为胞核内参； 主要实验步骤常规SDS-PAGE 凝胶电泳、转膜、免疫学处理和曝光。

1.8 统计学处理 以SPSS19.0 统计软件进行分析，数据结果以(x±s)表示，两样本均数比较采用t 检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LPS 刺激NR8383 肺泡巨噬细胞后NEAT1 和IL-6 mRNA 表达变化RT- qPCR 实验结果显示，LPS 刺激肺泡巨噬细胞后，胞内IL-6 mRNA（t=9.36，P＜0.01）和NEAT1 均表达上调（t=8.79，P＜0.01）（图1）。

图1 LPS 刺激肺泡巨噬细胞后NEAT1、IL-6 表达mRNA；*与对照组比

2.2 NEATl 沉默对NR8383 肺泡巨噬细胞IL-6 分泌的变化 图2A 结果表明，RNAi 转染成功地沉默了肺泡巨噬细胞NEAT1 表达(t=5.22, P<0.05)。 各组细胞分别用LPS 刺激，图2B 结果表明，正常细胞分泌少量IL-6，LPS 可诱导巨噬细胞分泌大量IL-6 (t=8.37,P<0.05)，RNAi 转染沉默NEAT1 后细胞IL-6 分泌量较转染对照序列细胞(siNC) 显著减少(t=4.61,P<0.05)。

图2 ELISA 检测NEAT1 沉默后LPS 刺激时肺泡巨噬细胞IL-6分泌量变化 与NC 组比较：*P＜0.01；与siNC 组比较#P＜0.05

2.3 NEAT1 沉默对LPS 诱导NR8383 肺泡巨噬细胞NF-κB 核移位的影响 NEAT1 沉默可抑制LPS诱导的NF-κB 核移位，表现为NF-κB p65 蛋白在细胞核内表达较LPS 组下调，见图3、表1。

3 讨论

图3 NEAT1 沉默对细胞NF-κB p65 蛋白核移位影响

表1 NEAT1 沉默对细胞NF-κB p65 蛋白核移位影响

严重脓毒症病人出现ARDS 时， 由于肺部强烈的炎症反应，肺泡-毛细血管通透性增加，造成渗透性肺水肿、透明膜形成、肺不张表现，使患者出现难治性严重呼吸困难。 肺泡巨噬细胞在该病的发生过程中，发挥重要的作用。 表现为在接受到感染因素刺激时，迅速分泌炎症因子，以对抗致病微生物入侵。 经典的炎症反应过程中，如革兰阴性菌LPS 通过与肺泡巨噬细胞膜表面的TLR4(Tolllike Receptor，TLR4） 结合， 启动炎症信号级联传导，活化NF-κB 炎性通路，启动IL-6、IL-1β 等炎症因子的合成、分泌过程[12]。 本研究证实，LPS 刺激情况下，NR8383 肺泡巨噬细胞炎症因子IL-6 合成显著上升。 即LPS 刺激肺泡巨噬细胞后有效启动了炎症免疫反应过程。

在炎症反应过程中， 存在许多参与炎症进程的分子。 lncRNA 是近年研究火热的一类炎症调控分子。如lncRNA NKILA 是内皮细胞炎症的关键抑制因子，与颈动脉粥样硬化有显著相关性[13]。 LPS可诱导巨噬细胞表达lncRNA HOTAIR， 而敲除HOTAIR 可抑制NF-κB 信号通路介导的炎症反应[14]。 lncRNA NEAT1 同样在炎症反应过程中发挥重要作用， 如吴缅教授课题组发现受低氧诱导因子HIF-2α 转录激活的NEAT1 可以直接参与炎症小体的组装和激活， 控制巨噬细胞促炎因子IL-1β和IL-18 的成熟和分泌， 是一个重要的促炎分子[15]。 在脓毒症肾损伤疾病模型中，NEAT1 可通过抑制NF-κB 活化， 下调肾系膜细胞IL-6、IL-1β 分泌，减少氧化应激分子一氧化氮产生[16]。 在肺泡巨噬细胞中，NEAT1 的功能知之甚少，我们通过实验发现，受LPS 刺激的NR8383 肺泡巨噬细胞一方面会上调表达NEAT1，另一方面在下调NEAT1 的细胞中IL-6 分泌减少， 表明NEAT1 可抑制LPS 所致肺泡巨噬细胞炎症反应。

哺乳动物中，NF-κB 是由p65/RelA、p50、p52、Rel-B、c-Rel 五种亚基以二聚体的方式组合构成的一个转录因子蛋白家族， 其中p65 与和p50 组成的异二聚体是NF-κB 最常见的二聚体。 在静息状态下抑制因子（IκB）与NF-κB 结合，以无活性状态存在于细胞浆中。 当炎症过程启动后，IκB 被磷酸化降解，释放出NF-κB。 游离活化的NF-κB 迅速入核，与DNA 特定位点结合，启动基因转录，产生细胞因子[17,18]。 本研究中，LPS 刺激NR8383 肺泡巨噬细胞可有效诱导NF-κB 信号通路活化， 表现为NF-κB p65 蛋白在细胞核内增多； 而通过siRNA 下调NEAT1， 可有效抑制NF-κB p65 蛋白在细胞核内表达。

综上，NEAT1 可抑制LPS 诱导的NR8383 肺泡巨噬细胞促炎反应过程，其机制可能与减少IL-6 分泌、抑制NF-κB 信号通路活化有关。