HPLC 法同时测定大果飞蛾藤中8 种成分
2020-03-27静崔小敏杨媛媛任慧田欢石会丽陈志永
胡 静崔小敏杨媛媛任 慧田 欢石会丽陈志永∗
(1.陕西省中医药研究院,陕西 西安710061; 2.陕西省中医医院,陕西 西安710003; 3.西安市食品药品检验所,陕西 西安710054)
大果飞蛾藤Porana sinensisHenmsl.为旋花科飞蛾藤属植物,又称异萼飞蛾藤,广泛分布于我国的华南、西南、华中及甘肃南部地区[1-3]。飞蛾藤属植物在民间作为药用的记载较少,仅《中药大辞典》 记载飞蛾藤Porana racemosaRoxb.可用于无名肿痛、劳伤疼痛及高烧的治疗[4]。丁公藤Erycibe obtusifoliaBenth.为我国传统民间用药,具有祛风除湿、消肿止痛的功效[5-7],是祛风湿中药冯了性风湿跌打药酒的君药[8-9]。近年来,由于生态环境恶化以及临床需求量的快速增长,丁公藤药材已不能满足人们的用药需求,大果飞蛾藤现已成为丁公藤的主流替代品种及《中国药典》 所载丁公藤的代用品[1,10]。
Chen 等[11]通过对丁公藤和大果飞蛾藤抗炎、镇痛功效,化学成分及生物活性3 方面的比较研究,证明两者都含有大量的绿原酸类和香豆素类,40%乙醇提取物都具有抗炎、镇痛作用,口服给药安全性高。杨媛媛等[2]初步制定了大果飞蛾藤的质量标准,建立了大果飞蛾藤中东莨菪苷、绿原酸和东莨菪内酯的含有量测定方法,但该方法忽视了大果飞蛾藤中新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸等具有广泛生物活性且含有量较高的成分。本研究首次建立HPLC 法同时测定大果飞蛾藤中新绿原酸、东莨菪苷、绿原酸、隐绿原酸、东莨菪内酯、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 的含有量,以期为其质量控制提供依据。
1 材料
Agilent 1260 系列高效液相色谱仪,配置VWD检测器和Agilent Chem Station 工作站(美国Agilent公司);KQ-100 型超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司);BS210S 型电子分析天平(万分之一,北京赛多利斯天平有限公司);BT25S 型电子分析天平(十万分之一,北京赛多利斯天平有限公司)。
对照品东莨菪苷(批号16040805,纯度≥98%)、东莨菪内酯(批号161208,纯度≥98%)、绿原酸(批号1701904,纯度≥98%)、隐绿原酸(批号17061401,纯度≥98%)、新绿原酸(批号17062003,纯度≥98%)、异绿原酸A(批号18090301,纯度≥98%)、异绿原酸B(批号17121201,纯度≥98%)和异绿原酸C(批号18070401,纯度≥98%)购自上海圻明生物科技有限公司。水为超纯水,乙腈为色谱纯试剂(美国Thermo Fisher 公司),其他试剂均为分析纯。
大果飞蛾藤药材批次1、6、8 为当地采收,其他批次药材均为产地购买。大果飞蛾藤药材所有批次样品经陕西省中医医院石会丽研究员鉴定为旋花科飞蛾藤属植物大果飞蛾藤Porana sinensisHenmsl.的干燥藤茎,信息见表1。
表1 样品信息Tab.1 Information of samples
2 方法与结果
2.1 色谱条件 Agilent 5TC-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B),梯度洗脱(0~15 min,5%~15% A;15~70 min,15%~25% A;70~90 min,25% A);体积流量1.0 mL/min;柱温25 ℃;检测波长345 nm;进样量10 μL。在本色谱条件下,大果飞蛾藤中8 种成分分离度良好,色谱图见图1。
图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents
2.2 供试品溶液制备 精密称取不同批次的样品粉末0.5 g(过40 目筛),置100 mL 具塞锥形瓶中。精密加入80%甲醇50 mL,称定质量。常温下超声处理30 min,放冷,用80% 甲醇补足减失质量。摇匀,过滤,取续滤液5 mL 转移至10 mL 量瓶中,40%甲醇定容至刻度。过0.45 μm 微孔滤膜即得。
2.3 对照品溶液制备 精密称取各对照品适量,置于8 个10 mL 量瓶中,加甲醇制成含绿原酸0.97 mg/mL、隐绿原酸0.68 mg/mL、新绿原酸0.38 mg/mL、异绿原酸A 0.62 mg/mL、异绿原酸B 1.16 mg/mL、异绿原酸C 0.55 mg/mL、东莨菪苷0.32 mg/mL、东莨菪内酯0.81 mg/mL 的对照品贮备液;精密量取上述对照品溶液各2 mL,混匀即得。
2.4 线性关系考察 精密量取对照品贮备液0.2、0.5、1、5、10 mL,用甲醇分别定容至10 mL 量瓶。在“2.1”项色谱条件下进样。以质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)进行回归,得到回归方程,结果见表2,可知各成分在各自范围内线性关系良好。
表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents
2.5 精密度试验 取“2.3”项下对照品溶液,在“2.1”项色谱条件下进样6 次,测得东莨菪苷、东莨菪内酯、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B 和异绿原酸C 峰面积RSD 分别为 0.88%、0.55%、0.55%、1.02%、1.21%、0.89%、0.76%、0.40%,表明该仪器精密度良好。
2.6 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液10 μL,在室温下放置0、2、4、8、12、24 h,在“2.1”项色谱条件下进样,测得新绿原酸、东莨菪苷、绿原酸、隐绿原酸、东莨菪内酯、异绿原酸B、异绿原酸A 和异绿原酸C 峰面积RSD 分别为0.72%、0.51%、0.82%、0.54%、1.31%、0.52%、1.43%、0.61%。表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。
2.7 重复性试验 精密称取同一供试样品,按“2.2”项下方法制备供试品溶液,平行6 份,在“2.1”项色谱条件下进样。测得新绿原酸、东莨菪苷、绿原酸、东莨菪内酯、异绿原酸B、异绿原酸A 和异绿原酸C 峰面积RSD 分别为1.88%、1.69%、1.71%、1.13%、1.61%、1.44%、1.53%、1.78%。表明该方法重复性良好。
2.8 加样回收率试验 精密称取已知8 个化合物含有量的大果飞蛾藤样品0.25 g,共称取6 份,精密称定,置100 mL 具塞锥形瓶中,分别精密加入各对照品适量。按“2.2”项下方法制备供试品溶液,在“2.1”项色谱条件下进样,计算各待测成分的加样回收率,结果见表3。
表3 各成分加样回收率试验结果(n=6)Tab.3 Results of recovery tests for various constituents(n=6)
2.9 样品含有量测定 分别取8 批大果飞蛾藤粉末各0.5 g,精密称定,按“2.2”项下方法制备供试品溶液,在“2.1”项色谱条件下进样,计算8 种成分的含有量。结果见表4。
由表4 可知,8 批大果飞蛾藤中新绿原酸含有量在0.183 6~0.342 8 mg/g 之间,东莨菪苷含有量在0.516 2~1.070 3 mg/g 之间,绿原酸含有量在0.525 8~0.917 3 mg/g 之间,隐绿原酸含有量在0.194 0~0.350 8 mg/g 之间,东莨菪内酯含有量在0.146 6~0.315 3 mg/g 之间,异绿原酸B 含有量在0.406 9~0.776 1 mg/g 之间,异绿原酸A 含有量在0.361 6~0.725 2 mg/g 之间,异绿原酸C 含有量在0.508 5~0.993 4 mg/g 之间;拟定各成分含有量最小值降低20%为含有量限度,待今后积累更多数据再做修订。则大果飞蛾藤药材中新绿原酸含有量不得少于0.146 9 mg/g,东莨菪苷含有量不得少于0.413 0 mg/g,绿原酸含有量不得少于0.420 6 mg/g,隐绿原酸含有量不得少于0.155 2 mg/g,东莨菪内酯含有量不得少于0.117 3 mg/g,异绿原酸B 含有量不得少于0.325 5 mg/g,异绿原酸A 含有量不得少于0.289 3 mg/g,异绿原酸C 含有量不得少于0.406 8 mg/g。
表4 各成分含有量测定结果(mg/g, n=3)Tab.4 Results of content determination of various constituents(mg/g, n=3)
3 讨论
3.1 流动相选择 本实验分别考察了甲醇和乙腈作为有机相对样品分离度的影响,乙腈-水分离效果明显较好;考察了不同浓度甲酸、磷酸对分离效果的影响,结果磷酸较甲酸分离效果好,最终选择0.1%磷酸溶液作为水相。综上所述,以乙腈-0.1%磷酸为流动相梯度洗脱时基线稳定,峰型和分离度比较好,故选择其作为流动相。
3.2 检测波长选择 据文献查阅和2015 年版《中国药典》 一部中东莨菪内酯和绿原酸类的紫外检测波长分别为298 nm[5]和327 nm[12-14];本实验在实际操作中考察了287、300、327、345、360 nm等多个波长条件下的出峰情况,发现在345 nm 条件下峰型好、分离度高,同时兼具了紫外吸收强等特点,故确定345 nm 为检测波长[6]。
3.3 指标性成分选取 本课题组在前期研究中发现大果飞蛾藤中含有大量的绿原酸类和香豆素类成分,尤其是3,4-二咖啡酰奎尼酸、3,5-二咖啡酰奎尼酸、4,5-二咖啡酰奎尼酸等在大果飞蛾藤中含有量较高[15]。二咖啡酰奎尼酸类成分具有抗炎[11,16]、抗氧化[17]等生理活性,而抗炎、抗氧化活性与大果飞蛾藤的抗风湿药效紧密相关。将二咖啡酰奎尼酸类成分作为大果飞蛾藤的质量控制指标性成分具有可行性。
本研究建立了8 种有效成分含有量的测定方法,该方法选取大果飞蛾藤中含有量较高且与大果飞蛾藤临床药效紧密相关的8 种成分作为指标性成分,以期所建立的多指标含有量测定方法有助于提升大果飞蛾藤质量控制水平,保证其临床应用的有效性和安全性。