湖北海棠总黄酮对卵巢早衰大鼠卵巢功能及骨代谢的影响

郭东艳 范妤 程江雪 张小飞 史亚军 邹俊波

1．陕西省中药基础与新药研究重点实验室/陕西中医药大学，陕西 咸阳712046

2．陕西中医药大学基础医学院，陕西 咸阳712046

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)也被称为原发性卵巢储备功能不全(primary ovarian insufficiency，POI)，是指 40岁前的女性出现以闭经、不孕、血清雌激素水平低下、促性腺激素水平升高等卵巢功能衰竭为特征的疾病，是妇科内分泌领域的常见病。低雌激素状态可继发骨质疏松、风湿性关节炎、糖尿病等疾病的患病风险。目前西医主要使用激素替代疗法，长期应用雌激素易产生高血凝状态、高血压、水肿等副反应，且乳腺癌、子宫内膜癌的发病危险升高，严重危害健康［1］。

近年来，作用温和的植物雌激素(phytoestrogen，PE)引起人们广泛关注。植物雌激素是指从天然植物中提取，其结构与内源性雌激素相似的一类化合物，当体内雌激素水平较低时，能够通过与雌激素受体结合模拟雌激素的理化作用［2］。湖北海棠是蔷薇科苹果属(malusmill．)湖北海棠［malushupehensis(pamp．)rehd］的干燥叶，主要成分为黄酮类及茶多酚。有研究［3］表明其黄酮类成分具有植物雌激素活性，对去势大鼠所致的骨质疏松有良好的治疗作用，但具体作用机制尚不清楚。

本实验在前期研究的基础上，以灌胃雷公藤多苷片复制成年大鼠卵巢早衰模型，研究湖北海棠总黄酮对卵巢早衰大鼠的卵巢功能及骨代谢的影响，并初步探讨其作用机制，为湖北海棠的进一步开发利用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:8周龄成年SD雌性大鼠48只，体质量(250±20)g，由西安交通大学实验动物中心提供，动物许可证号 SYXK－R(陕)2012－003。室温，不禁食不禁水，适应性饲养一周后用于实验。

1.1.2 实验药物及试剂:雷公藤多苷片购自湖南千金协力药业有限公司(批号20131102);戊酸雌二醇(补佳乐)购自拜耳医药保健有限公司(批号17OA);兔抗鼠ERα多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司(货号 bs－0725R);羊抗兔 IgG SABC免疫组化试剂盒(批号12I26C)购自博士德生物工程研究所;碘［125Ⅰ］雌二醇(E2)、［125Ⅰ］孕酮(P)、黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)放射免疫分析药盒，均购买于北京北方生物技术研究所(批号均为20130920);大鼠碱性磷酸酶ELISA试剂盒、大鼠骨碱性磷酸酶 ELISA试剂盒、大鼠1，25(OH)2D3ELISA试剂盒，均购自上海酶科生物科技有限公司;过氧化物歧化酶(SOD)(批号20140726)、丙二醛(MDA)(批号20140721)试剂盒购自南京建成生物工程研究所;HPD100型大孔树脂购自河北沧州宝恩化工有限公司。

1.1.3 仪器:北京东华原超高速低温抽出机;德国艾本德Centrifuge 5417R台式冷冻高速离心机;多功能成像系统;北京伯乐BIO－RAD Model680酶标仪;德国徕卡Leica RM2235切片机;德国蔡司ZEISS显微镜。

1.2 方法

1.2.1 湖北海棠总黄酮的制备:湖北海棠总黄酮提取物按照参考文献［4～6］制备提取纯化并测定含量。五种黄酮类成分的含量分别为金丝桃苷0.78%、槲皮苷5.3%、根皮苷19.7%、槲皮素1.18%、根皮素7.78%。

1.2.2 卵巢早衰模型建立:参考相关文献及前期预实验结果［7－8］，将48只 SD大鼠适应性饲养1周后开始实验，按照体重和随机数字表分为空白组、模型组、戊酸雌二醇组及湖北海棠总黄酮高、中、低剂量组，每组8只。除空白组外，其余各组每日灌胃雷公藤多苷片(75 mg/kg)，连续造模14 d，复制卵巢早衰模型。每日定时做阴道涂片，观察动情周期变化。

1.2.3 分组与给药方法:从第15天开始，模型组灌胃生理盐水(2 mL/kg);戊酸雌二醇组灌胃戊酸雌二醇(1 mg/kg);湖北海棠总黄酮高、中、低剂量组分别给予灌胃湖北海棠总黄酮(160、80、40 mg/kg)。每日1次，连续给药21 d。

1.2.4 取材:末次给药后禁食不禁水，16 h后通过水合氯醛麻醉，行腹主动脉采血，分离血清，－20℃保存备用。通过常规无菌操作法取大鼠双侧卵巢、子宫，称重;取材二分之一置于－80℃保存备用，剩余置于4%甲醛溶液中固定。

1.2.5 观察大鼠动情周期:每天早晨进行阴道脱落细胞涂片，HE染色后在光镜下观察动情周期变化，以判断模型复制是否成功。

1.2.6 卵巢、子宫脏器指数测定:取大鼠双侧卵巢、子宫，去除周围脂肪组织，用电子天平精密称重，计算脏器指数［脏器指数(%)=脏器湿重(g)/体质量(g)×100%］，结果以百分数表示。

1.2.7 血清性激素水平检测:采用放射免疫法测定血清中雌激素 (E2)、孕酮(P)、黄体生成素 (LH)和卵泡刺激素 (FSH)的水平。严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.8 卵巢、子宫形态学观察:卵巢、子宫组织在4%甲醛溶液中固定48 h后，经脱水、浸蜡、包埋、切片、脱蜡、HE染色、封片后，在光镜下观察卵巢及子宫内膜的组织学变化。

1.2.9 血清碱性磷酸酶、骨碱性磷酸酶、1，25(OH)2D3的检测:通过ELISA法检测血清中ALP、BALP、1，25(OH)2D3含量，严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.10 血清SOD活力、MDA含量的检测:通过TAB法检测血清中MDA的含量、WST－1法检测血清SOD活力，严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.11 SABC法检测卵巢组织中雌激素受体ERα蛋白的表达:一抗为兔抗鼠ERα多克隆抗体，二抗用生物素标记的羊抗兔IgG，操作严格按照试剂盒说明书进行，PBS代替一抗作为阴性对照，已知强阳性石蜡切片作阳性对照。结果使用 Image－pro plus7.1软件测定图片平均光密度(AOD)。实验重复3次。

1.3 统计方法

采用SPSS 18.0统计软件对数据进行单因素方差分析，以均数±标准差(珋x±s)表示各组动物的指标数据，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 湖北海棠总黄酮对卵巢早衰大鼠动情周期的影响

空白组雌性大鼠动情周期稳定，每个周期约3～4 d，分为动情前期、动情期、动情后期和动情间期。造模2周，除空白组外，各组大鼠动情周期紊乱并延长，阴道脱落细胞失去各期典型的形态学特征，表明给予雷公藤多苷片后，大鼠卵巢功能被抑制，激素的周期性分泌被干扰。给予湖北海棠总黄酮灌胃治疗3周后，各组大鼠动情周期逐渐趋于稳定，时间缩短，阴道脱落细胞回复正常周期性变化，且动情期角化细胞数量显著增多。见图1。

图1 大鼠动情周期各时项阴道脱落细胞形态变化(HE，×100)Fig．1 Morphological changes of vaginal exfoliated cells at different periods of estrous cycle in rats(HE，×100)

2.2 湖北海棠总黄酮对卵巢早衰大鼠卵巢指数、子宫指数的影响

雷公藤多苷片造模后，模型组大鼠子宫指数、卵巢指数、脾指数均较空白组降低，差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01);戊酸雌二醇组、湖北海棠总黄酮高剂量组大鼠子宫指数、卵巢指数、脾指数均较模型组升高，差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。模型组大鼠胸腺指数较空白组升高，戊酸雌二醇组、湖北海棠总黄酮高剂量组胸腺指数较模型组降低，具有显著性差异(P＜0.01)。肾上腺指数各组间差异无显著统计学意义(P＞0.05)。见表1。

2.3 湖北海棠总黄酮对卵巢早衰大鼠血清性激素水平的影响

与空白组比较，模型组大鼠血清E2、P含量降低，差异具有显著统计学意义(P＜0.01);戊酸雌二醇组及湖北海棠总黄酮高、中剂量组均能升高卵巢早衰大鼠血清E2、P水平，与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。模型组大鼠血清LH较空白组升高，差异具有统计学意义(P＜0.01)，戊酸雌二醇组及湖北海棠总黄酮高、中剂量组均能降低大鼠血清LH水平，与模型对照组比较有极显著性差异(P＜0.01)。各组血清FSH含量未见统计学差异(P＞0.05)。见表 2。

表1湖北海棠总黄酮对卵巢早衰大鼠脏器指数的影响(珋x±s，n=8)Table 1Effect of total flavonoids of Malus hupehensis on organ index in rats with premature ovarian failure(珋x±s，n=8)

表2湖北海棠总黄酮对卵巢早衰大鼠血清性激素水平的影响(珋x±s，n=8)Table 2Effect of total flavonoids of Malus hupehensis on serum sex hormone levels in rats with premature ovarian failure(珋x±s，n=8)

2.4 湖北海棠总黄酮对卵巢早衰大鼠子宫内膜形态学影响

空白组大鼠子宫内膜较厚，约占子宫壁2/3，上皮以高柱状分泌细胞为主，固有层可见较多子宫腺，且腺腔大，腔内可见分泌物，基质疏松，血管丰富。模型组子宫内膜薄，固有层子宫腺少，腺腔小，螺旋动脉稀疏。湖北海棠总黄酮不同剂量组与模型组比较，子宫内膜增厚明显，上皮以高柱状分泌细胞为主，固有层腺体增多，腺腔增大，腔内可见分泌物，基质疏松，多见螺旋动脉及丰富的毛细血管。见图2。

2.5 湖北海棠总黄酮对卵巢早衰大鼠卵巢组织形态影响

图2 湖北海棠总黄酮对卵巢早衰大鼠子宫内膜形态的影响(HE，×200)Fig．2 Effect of total flavonoids of Malus hupehensis on endometrium morphology in rats with premature ovarian failure(HE，×200)

空白组大鼠卵巢皮质可见各级卵泡相间分布，模型组与空白组比较，卵巢皮质中卵泡数量明显减少，尤其生长卵泡(初级卵泡和次级卵泡)所占比例明显下降，且闭锁卵泡增加。雌激素组生长卵泡数量明显多于模型组，且黄体数量接近空白组。湖北海棠各剂量组与模型组相比，生长卵泡与黄体数量均显著增多，黄体多见。见图3。

图3 湖北海棠总黄酮对卵巢早衰大鼠卵巢组织形态的影响(HE，×200)Fig．3 Effect of total flavonoids of Malus hupehensis on the morphology of ovarian tissue in rats with premature ovarian failure(HE，×200)

2.6 湖北海棠总黄酮对卵巢早衰大鼠血清碱性磷酸酶、骨碱性磷酸酶、1，25(OH)2D3含量的影响

实验结果显示，模型组大鼠血清ALP、BALP活力显著增加，与空白组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。戊酸雌二醇组及湖北海棠高、中剂量给药组大鼠血清ALP、BALP活力均显著下降，与模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。与空白组比较，模型组大鼠血清1，25(OH)2D3含量显著减少，差异有统计学意义(P＜0.01)。戊酸雌二醇组及湖北海棠不同剂量给药组大鼠血清1，25(OH)2D3含量均显著升高，与模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.05;P＜0.01)。见表 3。

表3 湖北海棠总黄酮对卵巢早衰大鼠血清ALP、BALP及1，25(OH)2D3含量的影响(珋x±s，n=8)Table 3 Effect of total flavonoids of Malus hupehensis on serum ALP activity，BALP content and 1，25(OH)2D3content in rats with premature ovarian failure(珋x±s，n=8)

2.7 湖北海棠总黄酮对卵巢早衰大鼠抗氧化能力的影响

模型组大鼠血清MDA含量显著高于空白组，差异有统计学意义(P＜0.01)，戊酸雌二醇组、湖北海棠总黄酮不同剂量组血清MDA含量显著低于模型组，具有显著统计学差异(P＜0.01)。模型组大鼠血清SOD活力显著低于空白组(P＜0.01)，戊酸雌二醇组、湖北海棠总黄酮不同剂量组血清SOD活力均高于模型组，差异有统计学意义(P＜0.01)。见表4。

表4 湖北海棠总黄酮对卵巢早衰大鼠血清MDA含量及SOD活力的影响(珋x±s，n=8)Table 4 Effect of total flavonoids of Malus hupehensis on MDA content and SOD activity in serum of premature ovarian failure rats(珋x±s，n=8)

2.8 湖北海棠总黄酮对卵巢早衰大鼠卵巢组织雌激素受体的表达影响

空白组可见卵巢组织中雌激素受体在黄体中表达显著，基质弱表达或不表达。模型组大鼠卵巢组织雌激素受体蛋白在黄体和基质中均呈现弱表达，与空白组比较具有显著性差异(P＜0.01)。戊酸雌二醇组、湖北海棠总黄酮各剂量组中，雌激素受体的表达较模型组均增强(P＜0.01)，在黄体组织中表达增强。见图4、表5。

图4 湖北海棠总黄酮对卵巢早衰大鼠卵巢组织雌激素受体(ERα)表达的影响(×200)Fig．4 Effect of total flavonoids of Malus hupehensis on estrogen receptor(ER alpha)expression in ovarian tissue of premature ovarian failure rats(×200)

表5 湖北海棠总黄酮对卵巢早衰大鼠卵巢组织中ERα的表达影响(珋x±s)Table 5 Effect of total flavonoids of Malus hupehensis on ER－alpha expression in ovarian tissue of premature ovarian failure rats(珋x±s)

3 讨论

雷公藤多苷提取自传统中药雷公藤，具有免疫抑制、抗炎作用，主要用于治疗类风湿关节炎、原发性肾小球肾病等自身免疫性疾病，其对生殖功能的抑制作用近年来被广泛应用于建立卵巢早衰的动物模型。灌胃雷公藤多苷可损伤卵巢功能，使卵巢分泌的雌激素、孕激素减少，反馈性促进促性腺激素分泌升高，动情周期紊乱，导致卵巢功能减退和(或)衰竭［9］。本实验中，给予大鼠灌胃雷公藤多苷片后，通过阴道脱落细胞学检测，发现大鼠动情周期紊乱并延长，失去各期典型的形态学特征，表明给予雷公藤多苷片后，大鼠卵巢功能被抑制，激素的周期性分泌被干扰，卵巢早衰动物模型成功建立。

目前临床治疗卵巢早衰的常用方法有激素替代疗法、诱导排卵法、免疫抑制剂疗法等［10］，但由于其不良反应大、疗效不稳定等原因，效果均不满意。长期的低雌激素状态常常会增加骨质疏松症发生的风险。中药中提取的植物雌激素来源广泛，与内源性雌激素结构和功能类似，当体内雌激素水平较低时，植物雌激素可以发挥弱雌激素效应;当体内雌激素水平过高时，植物雌激素可以竞争性地结合雌激素受体(estrogen receptor，ER)，因此被称为选择性雌激素受体调节剂(selectiveestrogenreceptor modulators，SERMs)，且副作用较小，在妇女围绝经期综合征中疗效显著，显示出良好的发展前景。湖北海棠总黄酮类是湖北海棠叶提取物，其中根皮苷含量最高，有报道［11］显示，根皮苷可与雌激素受体结合，发挥雌激素作用。本研究中，给予卵巢早衰大鼠湖北海棠总黄酮治疗后，血清中E2、P水平显著升高，FSH水平下降，子宫及卵巢重量增加，卵巢内生长卵泡数量增多，子宫内膜增厚，腺体分泌功能增强，表明湖北海棠总黄酮能够改善POF大鼠卵巢功能，并随剂量增加，作用随之增强。ALP和BALP由成骨细胞合成，是最常见的评价骨形成和骨转换的指标，可反映成骨细胞活性，是骨形成的特异性生化指标［12］。血清中1，25(OH)2D3是机体活力最强的维生素D的代谢产物［13］，在骨形成过程中起着重要的作用。湖北海棠总黄酮组大鼠血清中ALP活力、BALP含量均显著降低，1，25(OH)2D3含量均显著升高，表明湖北海棠总黄酮能够纠正由卵巢早衰引起的骨代谢紊乱，改善骨质疏松状态。

线粒体是细胞的动力工厂，卵巢颗粒细胞中线粒体功能下降是卵巢早衰的早期信号［14］。活性氧(ROS)是线粒体能量代谢产物，活性氧自由基主要有超氧阴离子自由基、羟自由基、过氧自由基、一氧化氮分子自由基等，失去电子的自由基将进行各种氧化还原反应，改变或损伤细胞的结构及功能［15］。超氧化物歧化酶(SOD)通过调控细胞内O2－和H2O2的稳态平衡清除ROS，消除或减轻超氧阴离子对细胞的损害。丙二醛(MDA)是颗粒细胞内氧自由基与细胞膜不饱和脂肪酸形成的脂质过氧化产物，反映细胞内脂质过氧化程度。MDA的生成量不仅反映氧自由基生成与否还反映脂质过氧化程度，因而测定MDA含量可推测脂质过氧化程度［16］。本研究发现，湖北海棠总黄酮能够提高卵巢早衰大鼠血清SOD活力，降低MDA含量，通过增强体内抗氧化能力清除过剩的氧自由基保护卵巢功能。

雌激素受体是通过配体结合激活的一类核受体超家族成员，雌激素的生物效应受到雌激素受体的调控。目前研究［17］报道其有 ERα和ERβ两种亚型，它们既可共存也可单独表达。二者在体内广泛分布，在子宫、卵巢、睾丸、骨等器官数量丰富。两种ER的配体结合特性虽然相似，但ERα对雌二醇的亲和力高于ERβ［18］。本实验中，湖北海棠总黄酮能够显著促进卵巢组织中颗粒细胞、基质细胞ERα的表达，在促进雌激素、孕激素分泌的同时，通过增加卵巢组织细胞内雌激素受体的数量，提高雌激素的作用，恢复卵巢功能。

综上所述，灌胃雷公藤多苷片后，成年大鼠卵巢储备能力下降，表现出卵巢早衰典型特征。经湖北海棠总黄酮治疗后，大鼠血清雌、孕激素水平升高，生长卵泡数量增多，卵巢功能显著改善，同时湖北海棠总黄酮通过发挥其类雌激素样作用对卵巢早衰继发的骨质疏松起到治疗作用。其作用机制与湖北海棠总黄酮增强了体内抗氧化能力、减轻卵巢内颗粒细胞损伤、增强颗粒细胞内雌激素受体的表达密切相关。