HPLC法同时测定茶叶中儿茶素类和咖啡因的含量

杨金川, 白雪梅

(1.贵州省产品质量检测检验院, 贵州 贵阳 550001; 2.贵州省市场监督管理局, 贵州 贵阳 550001)

茶叶起源于中国，是我国丰富的天然资源，并因其具有多种生理作用和药理活性，受到众多学者的关注，在活性成分茶多酚和咖啡因方面的研究较多。茶多酚(Tea polyphenol)，又称维多酚，是茶叶中30多种酚类物质的总称，约占茶叶干物质总量的25%～35%，主要包括儿茶素、黄酮类化合物、花青素和鞣酸四大类物质，其中以儿茶素含量最多，约占茶多酚总量的 65%～80%[1]。茶多酚具有抗衰老、抗疲劳、抑制肿瘤、抗菌、降血脂和降血糖等药理作用[1]，而儿茶素类是茶多酚中的主要成分，也是其主要的药理活性物质，其主要有没食子酸(GA)、表儿茶素(EC)、儿茶素(+C)、表没食子儿茶素(EGC)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、没食子儿茶素(GC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和表儿茶素没食子酸酯(ECG)，因此也是茶叶品质和茶多酚产品质量控制的重要指标；咖啡因(Caffeine)也是茶叶的主要成味物质和生理活性成分，具有多种生理作用，能作为药品使用，具有兴奋神经枢、强心、促进葡萄糖代谢、利尿、助消化及解毒等功效，但是儿童摄入过量咖啡因可诱使多动，长期食用会产生依赖性[2]。检测茶叶及茶制品中各种儿茶素及咖啡因的含量对于评价其功能品质具有重要意义。

目前，茶叶茶多酚中儿茶素类和咖啡因的检测主要有高效液相色谱法[3-4]、超高效液相色谱法[5]、液相色谱质谱法[6]和超高效液相串联质谱[7]等，检测中多采用梯度洗脱，易出现基线不平、分离度差、重现性差、分析时间长和对检测设备要求高等问题。为此，以绿茶和红茶中GA、GC、EGC、+C、ECG、EGCG、EC、GCG和CAF为研究对象，探索新的色谱分离条件，使得样品中所有儿茶素类化合物和咖啡因均得到良好的分离，并采用HPLC进行测定，以期为茶叶产品的等级评价和质量控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

茶叶样品：湄潭翠芽、都匀毛尖、云雾毛峰、遵义红红茶、红宝石红茶，均购于永辉超市。

仪器：Agilent-1260高效液相色谱仪(配UVD) ，安捷伦科技有限公司；Milli-Q Academic超纯水仪，密理博中国有限公司；DK-98-11电热恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 稳定溶液的制备 将25 mL EDTA溶液 (10 g/L)、25 mL抗坏血酸溶液 (10 g/L)和50 mL甲醇置于容量瓶中，以超纯水定容至500 mL，制得混合溶液。

对照品溶液的配制：分别准确称取各标准品适量，以甲醇定容配制标准储备液。其浓度分别为1.06 mg/mL(GA)、0.2 mg/mL(GC)、2.03 mg/mL (EGC)、1.04 mg/mL (+C)、2.02 mg/mL (CAF)、2.03 mg/mL (EGCG)、1.05 mg/mL (EC)、1.00 mg/mL (GCG)、1.99 mg/mL (ECG)。GA、CAF、EGCG、ECG各取0.50 mL，GC、EGC各取2.00 mL，+C、EC各取1.50 mL， GCG取 1.00 mL，各储备液混合均匀即得10 mL混合标准溶液。

1.2.2 试样的制备 准确称取0.2 g(精确到0.000 1 g)过40目筛的茶叶粉末置于15 mL离心管中，加入10 mL 70%甲醇，70℃水浴锅中提取10 min (隔5 min震荡1次)，于高速离心机中 (低温5℃，8 000 r/min)离心5 min，将上清液转移到25 mL容量瓶。残渣再用5 mL 70%甲醇重复提取1次，合并上清液，并用稳定溶液定容到25 mL，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，待测。

1.2.3 流动相的选择 通过查阅文献资料，梯度洗脱流动相主要分为甲醇 (V)∶ 酸溶液 (V)和乙腈(V)∶酸溶液(V)，通过试验验证甲醇 (V)∶ 酸溶液 (V)、乙腈(V)∶酸溶液(V)以及乙腈 (V)∶ 甲醇 (V)∶ 酸溶液 (V)为流动相的分离效果，通过不断优化条件，最终达到最佳色谱条件。

1.2.4 检测方法 色谱柱： Agilent C18色谱柱 (4.6 mm×250 mm, 5 μm)。检测波长：275 nm，流速1 mL/min，柱温30℃，进样量10 μL，在最佳流动相及梯度洗脱条件下进行测定。

1.2.5 标准曲线绘制 分别移取混合标准溶液50 μL、100 μL、200 μL、400 μL 和500 μL，用稳定液定容到1.00 mL 得一系列的标准溶液，在“1.2.4”检测条件下进行测定。以峰面积值(y)对进样浓度(x)进行线性回归。

1.2.6 重复性试验 将混合对照品溶液在最佳流动相及梯度洗脱条件下进行测定。连续进样5次，进样量10 μL。计算峰面积RSD值，考察峰面积的一致性。

1.2.7 加标回收试验 称取0.2 g(精确到0.000 1 g)茶叶粉末于15 mL离心管中，加入2.00 mL的9种化合物混合标准溶液，按“1.2.2”方法进行加标回收试验，平行进行5次样品测定，同时做空白样品试验，检测其本底成分，计算平均回收率及相对标准偏差RSD。

1.2.8 样品测定 取贵州市场上常见的湄潭翠芽、都匀毛尖、云雾毛峰、遵义红红茶及红宝石红茶5种茶叶，以“1.2.2”进行前处理，在最佳流动相及梯度洗脱条件下进行测定，3次重复，检测不同茶叶样品中的儿茶素类和咖啡因含量。

2 结果与分析

2.1 流动相的选择

试验表明，当流动相为甲醇(V)∶酸溶液(V)时，色谱图目标峰虽然可以分离，但峰型宽，且有一定的拖尾，影响检测灵敏度；当流动相为乙腈∶酸溶液(V)时，色谱图峰型较好，但EGCG和EC的分离效果不佳；最终结合甲醇和乙腈对分离度和峰型的特性，通过不断优化条件，最佳梯度洗脱条件为流动相乙腈 (V)∶ 甲醇 (V)∶ 0.5%乙酸 (V)=5∶10∶85，保持5 min；10 min内流动相改变为10∶20∶70；5 min内流动相改变为8∶20∶72，并保持2 min；最后3 min内改变流动相为5∶10∶85，保持1 min，共26 min。从图1～2可知，在最佳条件下，各目标物均有较好的分离度，并和样品杂质有较好的分离效果。

图1标准溶液中9种化合物的色谱图

Fig.1 Chromatograms of nine compounds in standard solution

Fig.2 Chromatograms of nine compounds in green tea sample

2.2 线性关系和线性范围

从表1可知，GA、GC、EGC、C、CAF、EGCG、EC、GCG和ECG的线性范围分别为2.6～26.5 μg/mL、2.0～20.0 μg/mL、20.3～203.0 μg/mL、7.8～78.0 μg/mL、5.0～50.5 μg/mL、5.1～50.8 μg/mL、7.9～78.8 μg/mL、5.0～50.0 μg/mL和5.0～49.8 μg/mL；相关系数分别为0.999 94、0.999 71、0.999 98、0.999 98、0.999 99、0.999 74、0.999 94、0.999 92和0.999 98；检出限分别为0.15 μg/mL、2.67 μg/mL、2.70 μg/mL、1.06 μg/mL、0.22 μg/mL、0.67 μg/mL、0.92 μg/mL、0.57 μg/mL和0.66 μg/mL。表明，茶叶中9种化合物在给定的浓度范围内线性关系良好，灵敏度高。

表1茶叶中儿茶素类及咖啡因的线性回归方程、相关系数及检出限

Table 1 Linear regression equations, correlation coefficients (R2),and limits of detection (LODs) of catechins and caffeine in tea

化合物 Compound线性范围/ (μg/mL) Linear range线性方程 Linear equation相关系数R2Correlation coefficient仪器检出限/ (μg/mL)LODGA2.6～26.5y=63.684 x-0.2320.999 940.15GC2.0～20.0y=5.631 x-0.7740.999 712.67EGC20.3～203.0y=5.124 x-2.0300.999 982.70+C 7.8～78.0y=12.696 x-1.7950.999 981.06CAF5.0～50.5y=55.207 x-3.5820.999 990.22EGCG5.1～50.8y=26.202 x-12.7560.999 740.67EC7.9～78.8y=12.881 x-0.8550.999 940.92GCG5.0～50.0y=28.001 x-5.5150.999 920.57ECG5.0～49.8y=33.345 x-4.9100.999 980.66

2.3 方法学考察

2.3.1 重复性 经测定， GA、GC、EGC、C、CAF、EGCG、EC、GCG和ECG峰面积RSD分别为0.47%、2.12%、0.63%、0.70%、0.48%、1.22%、0.41%、1.36%和0.68%，表明各化合物在最佳色谱条件下检测拥有良好的重复性。

2.3.2 精密度与回收率 由表2可知，该方法测定茶叶中儿茶素类及咖啡因的平均回收率为94.68%～104.40%，相对标准偏差(RSD)为0.89%～5.78%，表明该方法具有良好的精密度、准确性和重现性。

表2 茶叶中儿茶素类及咖啡因的加标回收率与相对标准偏差 (n=5)

2.4 样品中儿茶素类及咖啡因的含量

从表3可知，5种市售茶叶中，3种绿茶儿茶素类及咖啡因9种化合物均有检出，但含量存在差异，其中以CAF的含量最高，占9种化合物总含量的32.7%以上；茶多酚以EGCG、EGC、ECG及EC 4种为主，占9种化合物总含量的49.0%以上。2种红茶仅检出GA和CAF，其中以CAF的含量最高，占目标化合物的93.9%以上。

表3 茶叶样品中儿茶素类及咖啡因的含量

注：N.D.表示未检出。

Note: N.D. means non-detected.

3 结论

在前人的基础上，研究结合流动相甲醇和乙腈的特性，优化了乙腈∶甲醇∶0.5%乙酸溶液的梯度洗脱方法。在Agilent C18色谱柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，乙腈、甲醇、0.5%乙酸溶液为流动相进行梯度洗脱，柱温30℃，UV检测波长为275 nm条件下检测的各目标化合物GA、GC、EGC、C、CAF、EGCG、EC、GCG和ECG峰面积RSD值为0.41%～2.12%。样品加标平均回收率为94.68%～104.40%，相对标准偏差(RSD)为0.89%～5.78%，表明该方法具有良好的精密度、准确性和重现性。在市售5种茶叶中，绿茶中儿茶素类和咖啡因9种化合物均有检出，但其含量存在差异，这可能与茶叶的老嫩、茶树品种及制茶工艺的不同有关[8]；而2种红茶仅检出GA和CAF，表明，绿茶中的儿茶素类化合物明显高于红茶，说明红茶在发酵过程中会损失绝大部分茶多酚。该结论与侯冬岩等[9]研究的一致，未经发酵的生茶和经过渥堆陈化后的发酵茶中的化学成分及其含量有着明显的区别。而实际上，茶叶的品种、生长环境、放置时间及加工过程等，都会对茶多酚的含量有着显著的影响。