杏褪绿卷叶植原体新疆分离物可视化LAMP检测方法的建立

韩 剑， 陈开文， 纪文博， 陈 杭， 唐章虎

(1.新疆农业大学 农学院， 新疆 乌鲁木齐 830052； 2.新疆自治区高校农林有害生物监测与安全防控重点实验室，新疆 乌鲁木齐830052； 3.新疆农业科学院 轮台国家果树资源圃，新疆 轮台 841600)

杏褪绿卷叶病(Apricot chlorotic leaf roll，ACLR)是危害杏树的一种高致死性植原体病害，中国、欧洲和北美均将其列入进境植物检疫危险性病害名录[1-2]。该病害传染性极强，病原可通过嫁接传染、随无症带菌苗木远距离传播、介体昆虫(木虱、叶蝉)在感病树上取食后终生带菌传染，还可经卵传播[3]。2007年李文慧等[4]首次在新疆轮台县的杏园中发现杏褪绿卷叶病疑似病株，症状主要表现为叶片沿主脉向上翻卷成筒状，早衰落果，果小味差，轻者产量降低，重者树体整株死亡，并通过电镜观察确定引起杏褪绿卷叶病的病原为植原体。2010年韩冰[5]通过常规和巢氏PCR检测进一步确定引起新疆杏褪绿卷叶病的病原为植原体，通过序列相似性比较及系统发育研究，发现该植原体与植原体16SrⅤ-B亚组不同分离物的亲缘关系最近，暂时命名为杏褪绿卷叶植原体新疆分离物。植原体病害防治是目前公认的世界性难题，虽然药物治疗和控制昆虫介体具有一定减轻和延缓发病的作用，但无法根除且不能阻止病原的再次侵染，同时还会引起环境污染及果实农药残留超标等问题。由于植原体尚不能人工分离培养，目前对于植原体的检测主要是基于PCR技术发展出的巢氏PCR(Nested PCR)[6]、免疫捕获PCR(Immuno capture PCR)[7]和实时荧光PCR(Real-time PCR)[8]等，这些方法虽然大大提高了植原体检测的灵敏度和可靠性，但普遍存在检测时间长、操作过程复杂和成本高等特点，极大限制了其作为快速检测方法的推广使用。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是NOTOMI等[9]建立的一种新型核酸扩增技术，该方法具有检测成本低、速度快、操作简易、特异性强、灵敏度高和可视化检测等优点，非常适合在基层推广和病害现场的快速检测。目前该技术已广泛应用于植物病原菌的检测[10-12]，其中也包括一些植原体的LAMP检测技术。如SUGAWARA等[13]以groEL基因和16S rRNA为靶序列建立翠菊黄化植原体的LAMP检测方法；KOGOVEK等[14]以secA基因为靶标建立葡萄黄化植原体的LAMP检测方法；SIEMONSMEIER等[15]以16S rRNA为靶序列建立梨衰退植原体的LAMP检测方法。我国目前针对植原体建立的LAMP检测方法较少，仅见韩剑等[16]建立了枣疯病植原体LAMP可视化检测方法；王圣洁等[17]以tuf基因为靶标建立了检测5种16 SrⅠ组植原体的LAMP检测方法。目前针对杏褪绿卷叶植原体的LAMP的快速检测技术鲜见报道。因此，研究以tuf基因作为靶标基因设计LAMP引物，针对杏褪绿卷叶植原体新疆分离物建立快速、准确、灵敏、操作简便的LAMP可视化快速检测技术，以期为新疆杏褪绿卷叶病的田间快速诊断、抗性种质资源的筛选及高效检疫与防控提供技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料

杏褪绿卷叶病样品于2018年采自新疆轮台县国家果树资源圃，将采集的叶片上卷、叶肉有不规则褪绿斑的疑似杏褪绿卷叶病叶片及枝条于保鲜袋内带回实验室，保存于4℃和-20℃冰箱中；同时采集健康杏树植株枝叶作为对照。

泡桐丛枝植原体(Paulownia witches’ broom phytoplasma，PaWB)、枣疯病植原体(Jujube witches’ broom phytoplasma，JWB)、柳树丛枝植原体(Willow witches’ broom phytoplasma，WWB)和葡萄金黄化植原体(Flavescence dorée phytoplasma，FD)由新疆自治区高校农林有害生物监测与安全防控重点实验室保存提供，Bst 2.0 Warm StartRDNA聚合酶、1xThermoPol反应缓冲液均购于北京纽英伦NEB生物技术有限公司，MgSO4、dNTPs、甜菜碱(Betain)、钙黄绿素(Calcein)、Taq PCR Master Mix购于上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2 样品总DNA提取

采用CTAB法[18]提取杏树多年生枝条韧皮部总DNA，保存于-40℃低温冰箱中备用。

1.3 PCR检测

参照LEE等[19]的方法，根据植原体16S rDNA序列设计的通用引物R16mF2/R16mR2进行普通PCR检测。引物R16mF2：5′-CATGCAAGTCGAACGGA-3′，引物R16mR2: 5′-CTTAACCCCAATCATCGA-3′；普通反应体系为25 μL：DNA模板2.0 μL，引物 (10 μmol/L)各1.0 μL，Taq PCR Master Mix 12.5 μL，灭菌超纯水8.5 μL。反应条件：94℃预变性4 min；94℃变性45 s，50℃复性45 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min。反应结束后，取5 μL PCR产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 LAMP反应的建立和优化

1.4.1 LAMP引物的合成和设计 从GenBank中搜集不同组植原体tuf基因的核苷酸序列，利用DNAMAN对上述序列进行比较及一致性分析，找出杏褪绿卷叶植原体与其他植原体的基因差异位点和高度保守区域，利用在线软件Primer Explorer V5(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)设计多组引物，进而根据LAMP引物设计原理及要求，筛选出1套特异性引物，包括1对外引物ACLR-F3、ACLR-B3和1对内引物ACLR-FIP、ACLR-BIP(表1)。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司按照HPLC纯度级别合成。

表1 LAMP引物序列

1.4.2 LAMP反应条件的优化 根据已报道LAMP基本原理，初步设计并建立杏褪绿卷叶植原体的LAMP反应体系和程序，并对LAMP反应体系的主要影响因素进行优化。外引物与内引物浓度比为1∶1、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14；Mg2+为0～14.0 mmol/L，以0.5 mmol/L依次递增；dNTPs为0.2～1.6 mmol/L，以0.2 mmol/L依次递增；Bst 2.0 WarmStart®DNA聚合酶为1.6～12.8 U/μL，以1.6 U依次递增；甜菜碱为0～1.6 mmol/L，以0.5 mmol/L依次递增；钙黄绿素浓度1.25 mmol/L，MnCl2浓度0.4～2.5 mmol/L，以0.2 mmol/L依次递增。扩增温度55～68℃，依次递增，反应60 min；在最优扩增温度条件下，分别扩增20 min、30 min、40 min、50 min、60 min和70 min，确定最佳扩增时间。每次试验均以灭菌的超纯水作阴性对照。在恒温水浴锅中进行等温扩增反应，反应结束后取5 μL扩增产物在20 g/L的琼脂糖凝胶电泳中进行分析，同时肉眼观察PCR管中反应液的颜色变化，筛选出最优的反应体系及反应程序。

1.4.3 LAMP反应特异性的测定 分别以杏褪绿卷叶植原体(16SrⅤ组)、枣疯病植原体(16SrⅤ组)、葡萄金黄化植原体(16SrⅤ组)、泡桐丛枝植原体(16SrⅠ组)、柳树从枝植原体(16SrⅠ组)阳性样品及实验室保存的健康杏树基因组DNA为模板进行LAMP检测，反应结束后取5 μL的扩增产物在20 g/L的琼脂糖凝胶电泳中进行分析，同时用肉眼观察反应液颜色变化情况，确定其特异性。

1.4.4 LAMP反应灵敏度测定 提取患病杏树枝条韧皮部基因组总DNA，测定基因组DNA浓度，用灭菌超纯水按10倍梯度进行稀释，采用优化后的LAMP反应条件进行扩增，同时对稀释样品进行普通PCR检测，比较2种方法的灵敏度。

1.5 田间样品检测

在新疆轮台县采集疑似杏褪绿卷叶病植株枝条样品30份，采用CTAB法提取枝条韧皮部基因组DNA后，用建立的LAMP检测方法及普通PCR检测方法对提取的DNA进行检测，比较2种方法的阳性检出率和符合率，验证LAMP方法的可行性和准确性。

2 结果与分析

2.1 LAMP检测方法的建立

经优化，LAMP检测方法反应体系为25 μL，8 U/μL Bst 2.0WarmStartRDNA聚合酶0.5 μL，1×ThermoPol反应缓冲液2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 2.5 μL，10 mmol/L Betaine 2.0 μL，100 mmol/L MgSO41.5 μL，20 μmol/L内引物ACLR-FIP/BIP各1.5 μL，10 μmol/L外引物ACLR-F3/B3各0.5 μL，1.25 mmol/L calcein 1.0 μL，12.5 mmol/L MnCl21.0 μL，模板DNA 1.0 μL， 补足灭菌超纯水至25 μL。对不同反应时间和反应温度扩增结果的比较发现，反应40 min后阳性样品反应液颜色变为翠绿色，扩增温度从55～65℃均有梯形条带产生，且60℃时梯形条带最明亮，最终确定最佳反应程序为60℃水浴反应60 min，80℃灭活5 min终止反应。

电泳检测结果显示，ACLR出现明显的瀑布形条带，空白对照未出现任何条带(图1A)，肉眼观察反应液颜色的变化，阳性管中的颜色为翠绿色，空白对照管中显示的颜色为棕黄色(图1B)。

注：M:100 bp DNA Ladder，1为空白对照，2～5为杏褪绿卷叶植原体。

Note: M, 100 bp DNA Ladder; 1, blank control; 2-5, phytoplasma of ACLR.

图1ACLR-LAMP产物的琼脂糖凝胶电泳检测(A)与可视化检测(B)结果

Fig.1 Agarose gel electrophoresis (A) and visual detection (B) results of ACLR-LAMP products

2.2 LAMP检测方法的特异性

特异性试验结果(图2)显示，隶属于同组(16SrⅤ组)但不同亚组的葡萄金黄化植原体和不同组(16SrⅠ组)的泡桐丛枝植原体、柳树丛枝植原体以及健康杏树检测结果均为阴性(图2A)。建立的LAMP检测方法能够特异性地检出杏褪绿卷叶植原体新疆分离物(图2B-2)和同属16SrⅤ-B亚组的枣疯病植原体(图2B-3)，肉眼观察可见翠绿色，琼脂糖凝胶电泳呈特征性梯形条带。

注：A为可视化检测，B为琼脂糖凝胶电泳检测，M为100 bp DNA Ladder，1为健康杏树，2为杏褪绿卷叶植原体，3为枣疯病植原体，4为葡萄金黄化植原体，5为泡桐丛枝植原体， 6为柳树丛枝植原体，7为空白对照。

Note: A, agarose gel electrophoresis detection; B, visual detection; M, 100 bp DNA Ladder; 1, healthy apricot tree; 2, phytoplasma of ACLR; 3,Jujube witches’ broom phytoplasma; 4, Flavescence dorée phytoplasma; 5, Paulownia witches’broom phytoplasma; 6, Willow witches’broom phytoplasma; 7, blank control.

图2LAMP 特异性的琼脂糖凝胶电泳(A)与可视化(B)检测结果

Fig.2 Agarose gel electrophoresis (A) and visual detection (B) results from LAMP specificity analysis

2.3 LAMP检测方法的灵敏度

从图3看出，普通PCR对杏褪绿卷叶病植株韧皮部总DNA最小检出限为5.0 ng/μL，LAMP最小检出限为50 pg/μL， LAMP检测方法的灵敏度比普通PCR高100倍。

注：A为普通PCR检测， B为LAMP可视化检测；M为DL2 000 DNA Marker，1为 DNA浓度50 ng/μL，2为5.0 ng/μL，3为500 pg/μL; 4为50 pg/μL，5为5.0 pg/μL，6为空白对照。

Note: A, normal PCR detection; B, LAMP visual detection; M,DL 2000 DNA Marker; 1-5, DNA concentration is 50 ng/μL,5.0 ng/μL,500 pg /μL,50 pg/μL and 5.0 pg/μL respectively; 6, blank control.

图3普通PCR检测(A)和LAMP检测(B)ACLR灵敏度

Fig.3 ACLR sensitivity of normal PCR detection (A) and LAMP detection (B)

2.4 LAMP方法的田间应用效果

经对田间30份疑似杏褪绿卷叶病植株韧皮部总DNA样品的检测，LAMP方法阳性检出11份，常规PCR方法阳性检出4份，阳性检出率分别为36.6%和13.3%。表明，常规PCR检测方法灵敏度极低，建立的LAMP方法比常规PCR方法更敏感，可以稳定地实现对田间样品中杏褪绿卷叶植原体的检测。

3 结论与讨论

建立的LAMP检测方法最优反应体系为25 μL：8 U/μL Bst 2.0 WarmStart®DNA聚合酶0.5 μL，1×ThermoPol反应缓冲液2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 2.5 μL，10 mmol/L Betaine 2.0 μL，100 mmol/L MgSO41.5 μL，20 μmol/L内引物ACLR-FIP/BIP各1.5 μL，10 μmol/L外引物ACLR-F3/B3各0.5 μL，1.25 mmol/L calcein 1.0 μL，12.5 mmol/L MnCl21.0 μL，模板DNA 1.0 μL，补足灭菌超纯水至25 μL；反应程序为：60℃水浴反应60 min，80℃灭活5 min终止反应。建立的LAMP检测方法能够特异性地检出杏褪绿卷叶植原体新疆分离物，LAMP检测方法的灵敏度较高，比普通PCR检测方法高100倍。

植原体在世界范围内分布广泛，引起的植物病害已超过1 000余种，其中不乏一些重要的经济作物。植原体可通过介体昆虫、人工嫁接和苗木等无性繁殖方式传播，传染性极强，加之植原体病害防治困难，因此从源头杜绝病原，建立先进的检测技术才是防控此类病害的核心所在。近年来越来越多的诊断技术被应用于一些重要的植原体病害检测，而如何实现田间和现场的快速检测成为研究的一个焦点。以PCR技术为基础所开发的植原体诊断技术，依赖于昂贵的热循环仪器，限制了其在基层的推广及现场的应用。与PCR技术相比，核酸等温扩增技术具有简便、高效、快速，成本低廉等优点，如依赖核酸序列扩增(Nucleicacid sequence based amplification, NASBA)、环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)、链替代扩增(Strand displacement amplification, SDA)、滚环核酸扩增(Rolling circle amolification, RCA)和解链酶扩增(Helix dependent amplification, HAD)等核酸等温扩增技术已经相当成熟，正逐步在检验检疫、医学、食品等领域得到广泛应用[20]。研究建立的ACLR-LAMP检测体系摆脱了对昂贵热循环仪器的依赖，仅需1台水浴锅甚至1个55℃恒温保温杯即能在1 h内实现核酸的高效扩增，检测结果可通过肉眼观察直接判定，省去了通过琼脂糖凝胶电泳判定结果的繁琐步骤，极大提高了检测效率，因此非常适合在技术、条件相对落后的基层实验室、检验检疫机构及现场快速诊断使用，具有很高的实用价值。

LAMP特异性引物的设计，其关键在于靶标基因的选择和LAMP引物的筛选，靶标基因应选择亚组或种内高度保守、组间变异性较高的基因。目前以16S rRNA、23S rRNA、SecA、groEL、tuf等基因为靶标的植原体LAMP检测技术已见报道，但以不同靶标基因设计的LAMP引物其特异性存在较大差异。如JONGHE等[21]以植原体保守基因16SrRNA为靶标基因建立了16S rⅩ组植原体LAMP检测体系，仅能实现组间的特异性检测，而针对同组内不同亚组的植原体则无法进行明确鉴别。KOGOVEK等[14]以更具变异性的SecA基因为靶标建立了16SrⅫ-A亚组植原体的特异性LAMP检测体系，实现了从亚组水平上对植原体进行定性分析。与蛋白质合成有关的延伸因子EF-Tu(tuf)基因，是植原体进化演变的一个重要基因。研究发现，植原体tuf基因比16S rDNA基因的序列可变程度高，不同组之间相似性差异为17%左右，而同组不同亚组之间为3%左右[22]，因此更有利于设计组内不同亚组或株系的特异性LAMP引物。该研究以植原体持家基因tuf基因为靶标，设计并筛选出1套特异性LAMP引物，特异性检测结果表明，建立的LAMP检测体系能够特异性地检出杏褪绿卷叶植原体新疆分离物和同属16SrⅤ-B亚组的枣疯病植原体，而隶属于同组(16SrⅤ组)但不同亚组的葡萄金黄化植原体和不同组(16SrⅠ组)的泡桐丛枝植原体、柳树丛枝植原体检测结果为阴性，尽管设计的LAMP引物还无法区分同一亚组不同株系的植原体，但由于枣疯病植原体和杏褪绿卷叶植原体其寄主范围不同，因此并不影响其在实际检测中的应用。此外，由于研究供试的植原体种类较少，因此还需广泛收集植原体菌株，进一步评估其特异性。

对于实际样品的检测LAMP的灵敏性明显高于PCR检测方法，原因主要是LAMP体系中添加的BstDNA聚合酶具有逆转录酶活性，使得LAMP对于植物总DNA中的抑制剂(包括生物污染物)相较PCR反应不敏感[23-24]。该研究建立的LAMP检测体系灵敏度及对于田间疑似病样的检测结果均显著高于普通PCR。但不同研究建立的植原体LAMP检测方法的检测灵敏度存在较大差异。如SUGAWARA等[13]研究表明，以16S rDNA和groEL基因为靶标序列设计的不同LAMP引物组合其灵敏度存在明显差异，分别比常规PCR低10～100倍；王圣洁等[17]建立的16SrⅠ组植原体LAMP检测方法，灵敏度高于普通PCR但低于巢式PCR，原因可能与引物特性或无环引物有关；还有研究比较了不同荧光染料对LAMP灵敏性的影响，结果表明在LAMP反应前加入SYBR Green Ⅰ作为荧光染料，会破坏DNA双链的动态平衡，抑制LAMP反应。综上，LAMP检测方法的灵敏性与引物、靶标序列、测定方法等有着密切的关系。